朱 姝，吳志鵬，臧廣超，王以武，馬廉舉，劉 倩

(重慶醫(yī)科大學實驗教學管理中心，重慶401331)

0 引言

20世紀中期，日本海濱小鎮(zhèn)水俁發(fā)生大規(guī)模甲基汞中毒事件，對環(huán)境及人類健康造成毀滅性影響。自此，重金屬汞離子的破壞性影響開始引起全世界的警惕，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（UNEP）為控制和減少汞的排放通過了“水俁公約”[1-2]。眾所周知，汞離子是最具危害性的重金屬污染物之一，易從環(huán)境轉移到食物鏈中，并在人體累積，對大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腎臟等器官造成嚴重損害[3]。因此，開發(fā)高靈敏度、高選擇性的汞離子檢測方法具有重要意義。

電致化學發(fā)光（ECL）是電激發(fā)下的一種化學發(fā)光（CL）現(xiàn)象。通過將電化學和光譜學的巧妙結合，不僅簡化了實驗裝置，阻斷了發(fā)光雜質(zhì)和散射光的背景響應，靈敏度高，還具有較好的特異性、選擇性和再現(xiàn)性。因此，ECL技術已經(jīng)在微量檢測、食品與環(huán)境檢測和成像分析等多領域具有廣泛的應用[4]。基于“胸腺嘧啶-汞離子-胸腺嘧啶”（T-Hg2+-T）的穩(wěn)定結構[5]，研究者們設計了各種類型的針對汞離子的生物傳感器[6-9]。汞離子電致化學發(fā)光生物傳感器是將生物傳感技術與電致化學發(fā)光相結合，將汞離子濃度轉換為電致化學發(fā)光信號的一種新型傳感器。然而，為了實現(xiàn)汞離子的靈敏檢測，信號輸出模式成為構建其電致化學發(fā)光生物傳感器的關鍵。該文主要以信號輸出模式的不同，綜述了近幾年來基于汞離子電致化學發(fā)光生物傳感器的相關研究。

1 “signal on”型信號輸出模式

早期的研究中，單信號開關模式（以信號的減少或增加來響應分析物的存在）被廣泛應用于傳感器的構建，它具有靈敏度高、操作簡便、過程簡單等優(yōu)點[10-12]?！皊ignal on”型信號輸出模式的汞離子電致化學發(fā)光生物傳感器是一類隨著分析物汞離子濃度的增加，ECL信號逐漸增強的傳感器類型，是信號在目標物出現(xiàn)前后信號由弱到強的過程，也是最常見的信號輸出方式，其在原理上具有檢測范圍寬、背景信號低等特點[13-16]。基于汞離子極易被富含胸腺嘧啶的核酸捕獲的特性，Guangming Nie團隊采用核酸夾心法通過金屬汞離子直接引入發(fā)光物質(zhì)構建了一個“signal on”型信號輸出模式的電致化學發(fā)光生物傳感器（傳感器構建原理如圖1所示）[17]。傳感器以高導電性的聚（5-甲醛吲哚）/還原氧化石墨烯（P5FIn/erGO）作為基底修飾電極，通過醛基與氨基的共價偶聯(lián)作用接上富含胸腺嘧啶（T）的DNA單鏈（DNA S1）。金納米粒子（AuNP）連接石墨烯量子點（GQDs）-DNA S3和DNA S2作為ECL信號探針。AuNP的存在不僅可以增加GQDs的負載量，還能起到信號放大的作用。通過T-Hg2+-T的配位反應，在目標物Hg2+的存在下信號探針與DNA S1雜交，將其組裝到修飾電極上，從而實現(xiàn)了一個“signal on”型信號輸出模式。該修飾電極的ECL信號強度與Hg2+的濃度在0.01 nmol/L至100 nmol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性相關性，檢測限為2.48 pmol/L，實現(xiàn)Hg2+的靈敏檢測。

圖1 基于直接引入ECL信號探針DNA S3/AuNP/GQDs生物螯合物的“signal on”型電致化學發(fā)光生物傳感器的制備原理[17]Fig.1 Schematic diagram of the ECL sensor based on P5FIn/erGO nanocomposite and GQDs[17]Copyright 2019 Elsevier[17]

此外，Tian-Fang Kang團隊利用同時引入汞離子結合的電致化學發(fā)光共反應物的方式，成功構建了針對汞離子的“signal on”型信號輸出模式的電致化學發(fā)光生物傳感器[18]。如圖2所示，實驗設計將聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）和帶負電荷的CdSe/CdS量子點依次吸附在MoS2的表面形成QD-PDDA-MoS2復合材料，同時將其作為基底固定富含胸腺嘧啶的DNA序列（DNA 1），制備修飾電極。金納米粒子（AuNPs)結合另一種富含胸腺嘧啶的DNA序列（DNA 2）和葡萄糖氧化酶（GOD）形成GOD-AuNPs-DNA2偶聯(lián)物。反應池中同時引入GOD-AuNPs-DNA2偶聯(lián)物和Hg2+，依賴形成T-Hg2+-T絡合物將生成QDs共反應物H2O2的催化劑GOD引入。GOD催化葡萄糖與溶解氧反應生成H2O2，再與QDs作用使ECL信號放大，實現(xiàn)了信號隨汞離子的增加而增強。該傳感器的ECL信號強度與Hg2+的濃度在1.0×10-6mol/L至1.0×10-12mol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性相關性，檢測限為1.0×10-13mol/L，實現(xiàn)了Hg2+的靈敏檢測。

圖2 基于CdSe/CdS量子點和過氧化氫共反應發(fā)光的“signal on”型電致化學發(fā)光生物傳感器的制備原理圖[18]Fig.2 Fabrication process and the determination mechanisms of the electrochemiluminescence sensor[18]Copyright 2019 RSC

2 “signal-off”型信號輸出模式

在構建針對汞離子的電致化學發(fā)光生物傳感器中，另一種比較常用的信號輸出模式為“signal-off”型。它是與“signal-on”型相反的信號輸出模式，即隨著汞離子濃度的不斷增加，電致化學發(fā)光信號逐漸降低[19-21]。以目標物汞離子作為電致化學發(fā)光淬滅劑所構建的傳感器便順勢而生[22]。Ruo Yuan團隊首次發(fā)現(xiàn)汞離子對于乙基異魯米諾（ABEI）的電致化學發(fā)光有淬滅作用[23]。受到這一發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)，他們合成了ABEI功能化銀納米顆粒修飾的氧化石墨烯復合納米材料（GO-AgNPs-ABEI)作為發(fā)光物質(zhì)，并通過氨基與醛基的共價偶聯(lián)作用連接了具有較強促發(fā)光性能的二茂鐵標記的ssDNA（Fc-S1)。在H2O2存在下，其作為第一重的信號開關，產(chǎn)生較強的ECL信號。隨后，在適配體的作用下，通過雜化鏈反應將輔助ssDNA(S2)、富含胸腺嘧啶ssDNA(S3)的金納米顆粒（AuNPs-S2-S3)固定在傳感平臺上。通過強而穩(wěn)定的“T-Hg2+-T”配位作用，汞離子被AuNPs-S2-S3捕獲，有效地淬滅了ABEI的ECL信號，成功構建了信號“signal-off”的狀態(tài)。黏蛋白MUC1作為適配體特異性靶點與適配體結合，釋放捕獲Hg2+的核酸納米基團，重新開啟了信號，達到“on”狀態(tài)。該生物傳感器策略結合Hg2+的猝滅效應降低背景信號，利用目標信號的循環(huán)放大，成功地實現(xiàn)了對Hg2+和MUC1的檢測，且具有較寬的線性響應范圍。Hg2+的濃度在10.0 pmol/L至1.0 mmol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性相關性，檢測限為3.1 pmol/L[23](圖3)。

圖3 基于汞離子對ABEI發(fā)光淬滅作用所設計的“signal off”型電致化學發(fā)光生物傳感器[23]Fig.3 Fabrication of the signal-switchable ECL aptasensor for Hg2+and MUC1[23]Copyright 2016 ACS[23]

Fen Ma團隊則另辟蹊徑，通過引入目標物汞離子，使得發(fā)光物質(zhì)遠離電極表面而造成信號下降，從而構建了“signal-off”型信號輸出模式的電致化學發(fā)光生物傳感器[24]。DNA三向鏈接（DNATWJ)是一種獨特的分支結構，由三個連接在接點處的雙螺旋臂組成。靶向反應性DNA-TWJ是將反應性結構域作為形成連接的三條臂之一進行連接，結合后的構象變化會導致連接臂彼此之間重新定向。傳感器利用將發(fā)光探針釕配合物（Ru）標記的Hg2+特異性DNA-TWJ共價偶聯(lián)到經(jīng)4-氨基苯甲酸共價修飾的玻碳電極表面，達到ECL信號“on”的狀態(tài)。在Hg2+存在下，Hg2+與TW/Ru-J1結合后，TW/Ru-J1的構象發(fā)生變化，導致發(fā)光探針Ru遠離電極表面，從而降低ECL信號，達到“off”狀態(tài)。該生物傳感器在0.1 pmol/L至10 pmol/L范圍內(nèi)，隨著Hg2+濃度的增加，信號下降并呈線性相關，檢測限為0.04 pmol/L（圖4）。

圖4 基于靶觸發(fā)DNA三向鏈接所構建針對汞離子的電化學發(fā)光生物傳感器[24]Fig.4 Schematic diagram of the fabrication of DNA-TWJbased ECL biosensor for the detection of Hg2+[24]Copyright 2019 Elsevier

3 “signal on-off-on”型信號輸出模式

汞離子的電致化學發(fā)光生物傳感器“on-offon”型信號輸出模式具體來說包含三個步驟：第一步是初始的“signal on”狀態(tài)的構建，需要較強的ECL信號響應；第二步是引入靈敏的信號淬滅劑達到“signal-off”狀態(tài)；第三步“on”，即通過目標物汞離子的引入來消除淬滅劑的影響來實現(xiàn)[25-26]。與單獨的“signal on”和“siganl off”信號輸出模式相比，這種信號輸出策略不僅具有低背景信號和高靈敏度，而且還增強了分析檢測的特異性[27-28]。如圖5所示，Nian Hong團隊基于分子識別技術，研制了針對汞離子的“on-off-on”型信號輸出模式的電致化學發(fā)光生物傳感器[29-31]。傳感器通過將發(fā)光探針三聯(lián)吡啶釕（Ru(bpy)32+)、環(huán)糊精金納米粒子（CD-AuNPs)和Nafion復合材料修飾在玻碳電極（GCE）表面作為ECL基底獲得強的ECL信號。再依據(jù)分子識別策略將一端帶有二茂鐵的單發(fā)夾式DNA探針（Fc-Probe-DNA）通過超分子識別作用鏈接CD，獲得“off”信號。實驗證表明，在沒有Hg2+的情況下，探針保持著單一的發(fā)夾節(jié)后，因Fc作用導致Ru(bpy)32+的ECL淬滅；而在Hg2+存在下，探針更傾向于形成T-Hg2+-T絡合物，使Ru（bpy）32+的ECL信號明顯恢復，為Hg2+檢測提供了傳感平臺。

圖5 基于信號淬滅的“on-off-on”型信開關模式的汞離子電致化學發(fā)光生物傳感器制備[29]Fig.5 Schematic diagram of the fabrication process of ECL-biosensor for the determination of Hg(II)[29]Copyright 2017 Elsevier

隨著ECL研究的不斷進步，能量共振轉移的淬滅信號作用為ECL生物傳感器設計帶來了新的契機[29-31]。Jian-Ding Qiu團隊利用g-C3N4和DNA-Ag NCs的能量共振轉移設計了“on-off”的ECL信號輸出，借助Hg2+與DNA的T-Hg2+-T作用減弱能量轉移使信號“on”，獲得較靈敏的汞離子ECL生物傳感器[29-31]。Abdollah Salimi團隊則是利用CdTe@CdSQDs與金納米粒子的能量共振轉移設計了信號“on-off-on”輸出模式的汞離子電致化學發(fā)光傳感器，檢測線低至2 amol/L[29-31]（圖6）。

圖6 基于能量共振轉移的“on-off-on”型信開關模式的汞離子電致化學發(fā)光生物傳感器制備[31]Fig.6 Schematic representation of the ECL biosensor for Hg2+detection[31]Copyright 2018 Elsevier

4 比率型信號輸出模式

汞離子的電致化學發(fā)光傳感器信號的“開關”輸出模式主要是基于發(fā)光體ECL發(fā)射強度的變化。在檢測過程中由于某些環(huán)境變化，如非目標誘導試劑降解、共反應物濃度、pH值、濃度等影響發(fā)光效率，容易出現(xiàn)假陽性誤差。為了提高傳感器的準確性，近年來，研究者們提出了比率型ECL傳感器，其量化結果取決于兩個發(fā)光強度的比值變化而不是絕對值，通過自校準從而提供更精確的測量結果[32]。發(fā)光體三聯(lián)吡啶釕（Ru（bpy)32+）與含氮納米材料的共發(fā)光的特性為ECL比率型傳感器的發(fā)展提供了契機[33-34]。Ru-Ping Liang團隊基于Au-g-C3N4NSs和Ru(bpy)32+雙電位電致化學發(fā)光的特性建立了一種簡單、靈敏、選擇性好的比率型ECL傳感器[35]（圖7）。

圖7 汞離子電致化學發(fā)光比率型傳感體系構建原理圖[35]Fig.7 Ratiometric ECL method for Hg2+monitoring just using Ru(bpy)32+as emitter and Au-g-C3N4NSs as onelectrode coreactant[35]Copyright 2020 RSC

5 總結和展望

電致化學發(fā)光在理論和實際應用方面的迅速發(fā)展，有力地證明了其是超靈敏測定重金屬離子的一種重要途徑。而基于Hg2+自身與胸腺嘧啶的配位特性，針對Hg2+所構建的電致化學發(fā)光生物傳感器則順勢而生。該文根據(jù)不同的開關模式，回顧了ECL檢測Hg2+的原理、優(yōu)點和應用。這些成果擴展了電致化學發(fā)光檢測Hg2+的檢測策略，推動了針對Hg2+的高通量和便捷式電致化學發(fā)光檢測。而隨著電致化學發(fā)光分析技術的發(fā)展，構建比率型電致化學發(fā)光傳感器以及如何結合化學研究領域中的新發(fā)現(xiàn)將成為未來的研究熱點及方向。

致謝：

本項目得到了重慶醫(yī)科大學實驗教學管理中心創(chuàng)新人才促進計劃（LTMC201903）和重慶醫(yī)科大學大學生科學研究和創(chuàng)新實驗項目（SRIEP201966）資助。