金 晶

（湖北恩施學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北恩施445000）

0 引言

蘆丁作為一種黃酮類(lèi)化合物廣泛的存在于天然產(chǎn)物蕓香科和石楠科植物中[1]，是一味天然藥物且含量豐富，蘆丁對(duì)很多疾病有很好的治療及緩解作用，如糖尿病、心腦血管疾病、痛風(fēng)、肥胖、高血壓等[2-4]，目前已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于對(duì)疾病的治療及病痛緩解。如：珍菊降壓片作為一種常見(jiàn)的降壓藥，在臨床上其降壓效果平穩(wěn)，見(jiàn)效快，幾乎無(wú)副作用產(chǎn)生，該藥一直受到很多高血壓患者的青睞是常用的降壓藥，蘆丁作為其中的一種主要成分，其藥理作用主要是改變?nèi)梭w內(nèi)毛細(xì)血管的通透性和張力的大小，和其他四種成分野菊花膏粉、珍珠層粉、鹽酸可樂(lè)定、氫氯噻嗪共同協(xié)同作用達(dá)到降壓的目的。故蘆丁的含量的測(cè)定對(duì)藥片的制備具有非常重要的意義。目前蘆丁的測(cè)定方法有很多，其中電化學(xué)方法對(duì)蘆丁測(cè)定有熒光探針猝滅法[5]、方波伏安法（SWV）[6]、循環(huán)伏安法（CV）[7]、差分脈沖伏安法（DPV）[8]、液相色譜法-電化學(xué)發(fā)光等[9]，這是由于電化學(xué)方法具有靈敏，快速，成本低的特點(diǎn)?；诖藢?shí)驗(yàn)采用CV和DPV連用的方法，在活化玻碳電極（AGCE）上電沉積納米鉑粒子（PtNPs），PtNPs具備優(yōu)良的傳導(dǎo)電子的能力是一種優(yōu)良的導(dǎo)電材料，與AGCE結(jié)合后使得電極的導(dǎo)電能力進(jìn)一步增加，構(gòu)建的電極對(duì)蘆丁有很好的電化學(xué)響應(yīng)，并成功的用于測(cè)定珍菊降壓片中蘆丁的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

JSM-7800F掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司），CHI660E電化學(xué)工作站(上海CHI公司)；三電極體系：工作電極為玻碳電極，參比電極為Hg/Hg2Cl2(飽和KCl)，并以鉑絲電極作為對(duì)電極；KQ218超聲波洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

1.2 試劑

H2PtCl6·6H2O(99.9 wt%)購(gòu)于Alfa Aesar（美國(guó)）。濃硫酸購(gòu)武漢市中天化工有限責(zé)任公司（中國(guó)武漢）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸、硼酸、乙酸、氫氧化鈉均從國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)上海）購(gòu)買(mǎi)。不同pH的B-R緩沖溶液（用由0.04 mol/L的磷酸、硼酸、乙酸和0.2 mol/L氫氧化鈉溶液混合配置而成）。珍菊降壓片 （產(chǎn)品編號(hào)：14002081692）購(gòu)于恩施州中心醫(yī)院，二次蒸餾水，所用試劑都是分析純?cè)噭?/p>

1.3 電極的制備

將玻碳電極（GCE）依次用0.3、0.1、0.05μm的Al2O3打磨光亮，然后分別用二次蒸餾水、丙酮、乙醇超聲清洗5 min，沖洗后室溫下晾干。取4支上述電極，分別采用四種活化方式[10-11]對(duì)電極進(jìn)行處理。四種活化方式參數(shù)如下（1）酸法循環(huán)伏安法：0.5 mol/L H2SO4溶液中，電位窗口為-0.5～1.6 V之間，以0.1 V/s的掃速至電化學(xué)響應(yīng)曲線穩(wěn)定；（2）酸法恒電位法：0.5 mol/L H2SO4溶液中，電極分別在2.0 V、-1.0 V恒電位條件下極化1 min；（3）堿法循環(huán)伏安法：在0.5 mol/L NaOH溶液中，電位窗口-0.5～1.2 V之間，以0.1 V/s的掃速至電化學(xué)響應(yīng)曲線穩(wěn)定（4）堿法恒電位法：0.5 mol/L NaOH溶液中分別在1.5 V、-0.5 V恒電位條件下極化1 min。將電極活化后然后采用循環(huán)伏安法在-0.5～0.8 V以0.1 V/s的掃速至電化學(xué)響應(yīng)曲線穩(wěn)定，并分別對(duì)10μmol/L蘆丁進(jìn)行檢測(cè)得到的電化學(xué)響應(yīng)曲線進(jìn)行比較選取最佳活化方式。以最佳活化方式活化的電極得到AGCE，置于H2PtCl6（1%）溶液中在-0.2 V的條件下恒電位沉積納米鉑，形成Pt NPs/AGCE電極。電極形成過(guò)程圖如圖1所示。

圖1 電極的形成過(guò)程Fig.1 the formation process of the electrode

2 結(jié)果與討論

2.1 鉑納米顆粒的掃描電鏡表征

從圖2可以清晰的看到粒徑為10～20 nm之間的鉑納米粒子，均勻的附著在玻碳電極表面，證明PtNPs/AGCE電極的成功構(gòu)建。

圖2 PtNPs/AGCE的掃描電鏡圖Fig.2 SEM image of PtNPs/AGCE

2.2 不同活化方式的比較

圖3為四種不同的活化方式活化的電極對(duì)蘆丁的CV電化學(xué)響應(yīng)圖，各電極對(duì)蘆丁測(cè)定的CV響應(yīng)曲線是以pH=3的B-R緩沖溶液為支持電解質(zhì)，在掃描區(qū)間為0.2～0.8 V，掃速為0.1 V/s的條件下得到的，與文獻(xiàn)所報(bào)道的相一致[10]，由圖可以看出兩種酸法活化法的峰電流比兩種堿法活化法的峰電流都要大，但背景峰電流卻非常大，且對(duì)于酸法活化不能保證每次的背景峰電流的穩(wěn)定性，這對(duì)蘆丁的含量有很大的影響，綜合考慮選擇穩(wěn)定較好背景峰小的堿法恒電位法做為活化電極的最佳方法。

圖3 四種不同活化方式的比較:(a)酸法循環(huán)伏安法;(b)酸法恒電位法;(c)堿法恒電位法;(d)堿法循環(huán)伏安法Fig.3 The comparison of four different activation methods:(a)Cyclic voltammetry acid method;(b)Potentiostatic acid method;(c)Cyclic voltammetry alkaline method(d)Potentiostatic alkaline method

2.3 蘆丁在不同電極下的CV響應(yīng)

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了GCE（a）、AGCE（b）和PtNPs/AGCE（c）這三種不同電極對(duì)蘆丁的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)（圖4），發(fā)現(xiàn)隨著電極的不斷形成，蘆丁在電極表面的氧化還原峰電流不斷增強(qiáng)，峰電位也不斷縮小，蘆丁在PtNPs/AGCE上氧化峰電流與還原峰電流之比為1.32，峰電位為27 mV，與標(biāo)準(zhǔn)氧化還原峰電位59/n（其中n為轉(zhuǎn)移電子數(shù)）相比，表現(xiàn)出準(zhǔn)可逆的氧化還原反應(yīng)且轉(zhuǎn)移電子數(shù)為2。

圖4 蘆丁在不同電極下的響應(yīng)(a)GCE(b)AGCE(c)PtNPs/AGCEFig.4 curent response of Rutin under different electrode(a)GCE(b)AGCE(c)PtNPs/AGCE

2.4 條件優(yōu)化

為了使構(gòu)建的電極對(duì)蘆丁的測(cè)定達(dá)到最佳的狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)對(duì)掃速、pH鍍鉑量進(jìn)行了考察，當(dāng)掃描速度從0.02～0.1 V/s逐漸增加時(shí)，蘆丁在電極上的氧化還原峰電流的不斷增加（圖5 A），還原峰電流分別與掃速成良好的線性關(guān)系，線性方程為 IμA=(21.65±1.07)v(V/s)+(0.17±0.06)， R2=0.9886這說(shuō)明了蘆丁在檢測(cè)體系中表現(xiàn)為吸附控制，實(shí)驗(yàn)選取了0.1 V/s作為最佳掃速。

圖5 條件優(yōu)化(A)掃描速度(B)pH(C)鍍鉑的時(shí)間Fig.5 conditions optimization(A)scanning speed(B)pH(C)platinum plating time

圖5B為PtNPs/AGCE在不同pH下蘆丁DPV電化學(xué)響應(yīng)曲線，圖中可以看出隨著pH值的的不斷增加，電流值不斷減小，峰電位發(fā)生了明顯的偏移，且峰電位與pH值的大小呈線性關(guān)系，Epa=-(0.05623±0.0027)pH+(0.6787±0.0132)，R2=0.9911，與能斯特方程的斜率做比較-0.059 m/n（其中m為參與反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)，n為反應(yīng)電子轉(zhuǎn)移數(shù)）做比較，則可以推斷出蘆丁在氧化反應(yīng)過(guò)程中是等質(zhì)子等電子參與的反應(yīng)，pH=3的BR緩沖溶液中蘆丁表現(xiàn)出最強(qiáng)的峰電流故選其作為支持電解質(zhì)。

納米鉑的量直接會(huì)影響電極的導(dǎo)電性，故實(shí)驗(yàn)對(duì)鍍鉑量進(jìn)行了考察，圖5C中可以看出隨著鍍鉑時(shí)間的不斷增加DPV峰電流不斷增強(qiáng)當(dāng)時(shí)間到達(dá)120 s時(shí)峰電流達(dá)到最大，隨后逐漸下降，這是由于鍍的納米鉑太厚阻礙了電子的傳遞，故選取120 s作為最佳鍍鉑時(shí)間。

2.5 對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定

在最優(yōu)化的條件下，采用DPV方法在電位區(qū)間0.2～0.8 V內(nèi)，對(duì)不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液平行測(cè)定三次，得到的結(jié)果如圖6所示，當(dāng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在0.05～16μmol/mL時(shí)隨濃度的不斷增大，峰電流與濃度呈良好的線性關(guān)系，得到的線性方程為IμA=-(0.4160±0.0163)cμmol/L-(2.8673±0.1319)(R2=0.9909)，并有一個(gè)較低的檢測(cè)限為0.006μmol/L(S/N=3)。

圖6 對(duì)不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)及線性關(guān)系，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為:0.1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、15μmol/LFig.6 detection of different concentrations rutin standard solution and the linear relationship,concentration of rutin respectively:0.1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、15μmol/L

2.6 電極的選擇性、穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度

為了考察電極在對(duì)蘆丁檢測(cè)時(shí)的抗干擾能力，實(shí)驗(yàn)引入了的抗壞血酸、L-半胱氨酸、葡萄糖及常見(jiàn)的離子Zn2+、Ca2+、K+、SO42-、Cl-濃度均為100μmol/L作為干擾物，當(dāng)檢測(cè)體系分別只含有上述分子或離子時(shí)，DPV峰電流幾乎沒(méi)有響應(yīng)，分別加入10μmol/L蘆丁后的電流值與只含10 μmol/L蘆丁的峰電流比較，峰電流值的變化小于5%，則證明PtNPs/AGCE對(duì)蘆丁是有很好的選擇性。實(shí)驗(yàn)用一只電極考察了電極測(cè)定蘆丁的穩(wěn)定性，分別考察了12 h、24 h、48 h、72 h、96 h電極的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)電極在72 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，且RSD=1.86%。隨后制備6支電極考察了電極制備過(guò)程的重復(fù)性，并對(duì)10μmol/L蘆丁進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果之間的RSD=3.43%，說(shuō)明電極制備方法是可以重復(fù)的。用一支電極對(duì)蘆丁溶液進(jìn)行平行6次測(cè)定以對(duì)電極的精密度考察，峰電流之間的RSD=2.57%，證明電極具有良好的精密度。

2.7 對(duì)珍菊降壓片中蘆丁的測(cè)定

取珍菊降壓片20片稱(chēng)量其總重并計(jì)算出平均片重，然后用研缽將藥片研細(xì)，并稱(chēng)取四分之一倍平均片重粉末的量（每片含蘆丁20 mg）置于100 mL的容量瓶中，加50 mL pH=3的B-R緩沖溶液超聲溶解30 min后定容，搖勻，過(guò)濾，取10 mL濾液于100 mL的容量瓶中用緩沖溶液稀釋定容至刻度，搖勻，同時(shí)制備三份待測(cè)樣品溶液。將制備好的電極對(duì)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，得到結(jié)果的平均值為7.91±0.26μmol/L，與理論值8.19 μmol/L相比較相差3.4%，證明AuNPs/AGCE可以用于對(duì)珍菊降壓片制備過(guò)程中蘆丁含量的檢測(cè)。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

將上述制備的樣品溶液稀釋為原濃度的一半分成四份，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品使得四份樣品溶液中分別含有0，2，4，6μmol/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，將配好的溶液進(jìn)行檢測(cè)得到如表1所示的結(jié)果，電極表現(xiàn)出良好的回收率在96.5%～103.3%之間，RSD范圍在2.54%～4.31%，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度，進(jìn)一步證明了該電極不僅可以用于對(duì)珍菊降壓片中蘆丁的檢測(cè)。

表1 珍菊降壓片中蘆丁的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Measurement results of rutin in Zhenjujiangya Tablet

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用PtNPs與AGCE電極兩者的協(xié)同作用構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單靈敏的測(cè)定蘆丁的方法，對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)有一個(gè)較寬的線性范圍和一個(gè)較低的檢測(cè)限，經(jīng)驗(yàn)證該電極具備良好的穩(wěn)定性，重復(fù)性和精密度，在對(duì)珍菊降壓片中蘆丁含量的測(cè)定時(shí)，測(cè)定值與理論值只相差3.4%。該方法簡(jiǎn)單，且對(duì)蘆丁測(cè)定穩(wěn)定，可以推廣到對(duì)其他藥片中蘆丁含量的測(cè)定。