邢碩暉，李亞城，卿志和

（長沙理工大學化學與食品工程學院，細胞化學湖南省重點實驗室，湖南長沙410114）

0 引言

納米酶是一類具有天然酶類似活性的納米材料，自2007年Yan課題組發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米顆粒有類辣根過氧化物酶樣活性以來[1]，各種材料在納米尺度下的酶樣性質受到了廣泛關注。迄今為止，科研人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸如Au、Pt、Pd等、V2O5、CeO2等金屬氧化物和氧化石墨烯、碳納米管等碳基材料在納米尺度下都表現(xiàn)出類酶活性。此外，科研人員還通過材料摻雜、表面修飾等方式創(chuàng)造了各種功能各異、特點突出的組合納米酶材料。納米酶也表現(xiàn)出多種酶活性，目前，已發(fā)展了具有過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶、核酸酶等多種酶樣活性的納米酶，納米酶應用范圍得到了極大的拓展[2]。如今，這些納米酶材料在生化傳感、環(huán)境監(jiān)測、傷口抑菌、腫瘤治療等領域已有了廣泛的應用研究[3]。該文將對納米酶的材料和活性分類及其在生化傳感中的應用進行總結。

1 納米酶

1.1 納米酶材料分類

1.1.1 金屬納米酶

具有類酶催化活性的金屬材料已被多次報道。金屬納米酶材料被首次報道是Rossi等發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽還原合成的金納米顆粒可充當葡萄糖氧化酶的效果，催化氧化葡萄糖而生成葡萄糖酸和過氧化氫[4]。Gao的課題組曾對納米金、銀、鈀、鉑進行對比，探究pH變化時隨之變化的過氧化氫酶和模擬過氧化物酶樣活性的原理[5]。Zhao等合成了十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）穩(wěn)定的鉑納米立方體，表現(xiàn)出類過氧化物酶活性[6]。如圖1所示，F(xiàn)an等報道了一種自催化、自調節(jié)的金納米顆粒，表現(xiàn)出葡萄糖氧化酶活性[7]。Yin及其合作者制備了兩種結構的Pd納米酶[8]，分別為六面體和八面體。結果發(fā)現(xiàn)，Pd八面體的類超氧化物歧化酶活性和類過氧化氫酶活性比Pd六面體更高，Pd八面體消除活性氧的能力更強。除貴金屬納米顆粒外，科研人員也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些其他金屬組成的納米顆粒也具有類酶催化活性。比如Liu及其合作者制備了一種具有良好生物相容性的具有類氧化酶活性的Se納米顆粒，可以催化溶解氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）[9]。

圖1 金納米顆粒表現(xiàn)出葡萄糖氧化酶活性[7]Fig.1 Gold nanoparticles exhibited glucose oxidase activity[7]

1.1.2 金屬氧化物

金屬氧化物也被發(fā)現(xiàn)具有酶樣活性，且其具有易合成、穩(wěn)定性好、成本較低等特點，因此成為廣受研究的納米酶種類。除最典型的Fe3O4外，多種金屬氧化物納米酶被開發(fā)。Korsvik等證明氧化鈰納米粒子具有類似超氧化物歧化酶（SOD）的活性[10]。他們通過X射線光電子能譜證明，納米氧化鈰中的Ce3+/Ce4+具有固有的價態(tài)切換能力，因而具有了SOD酶樣活性。他們隨后做了進一步探究，發(fā)現(xiàn)是Ce3+和Ce4+氧化態(tài)的循環(huán)和納米氧化膜表面Ce3+的再生使SOD模擬物具有長期的SOD酶活性。Mu等觀察到立方Co3O4納米顆粒具有雙重固有的模擬酶活性，即過氧化氫酶和類過氧化物酶活性[11]。如圖2所示，Chen等發(fā)現(xiàn)粒徑在30 nm左右的CuO納米粒子顯現(xiàn)出類過氧化物酶活性，并發(fā)現(xiàn)CuO納米顆粒對TMB的親和力更強[12]。Tremel等報告了基于V2O5的納米酶的優(yōu)異活性，其中類V-HPO的V2O5納米線可以防止海洋生物污染，所制備的功能材料對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較強的抗菌活性[13]。

圖2 CuO納米顆粒表現(xiàn)出過氧化物酶活性[12]Fig.2 CuO nanoparticles exhibited peroxidase activity[12]

1.1.3 碳基材料

除金屬納米顆粒和金屬氧化物納米材料，碳基納米材料也是納米酶重點類別之一，主要包括富勒烯、碳納米管、石墨烯以及它們的各種衍生物等。2010年，Qu等首次報道了單壁碳納米管（SWCNTs）具有類似過氧化物酶的活性[14]，且其活性受pH、溫度和H2O2濃度影響。在濃硫酸和硝酸中超聲去除SWCNTs中的鈷后，SWCNTs依然具有類似的過氧化物酶活性，證實了是SWCNTs，而不是微量的金屬促進了催化活性。石墨烯是一種二維碳納米材料，由碳原子以sp2雜化軌道組成，Song等發(fā)現(xiàn)石墨烯也具有過氧化物酶樣活性[15]。鑒于氧化石墨烯納米顆粒極高的表面體積比和對有機底物的高親和力，其與辣根過氧化物酶（HRP）比，對TMB的親和力更高，對H2O2的親和力更低。如圖3所示，Dong等合成了含血紅素的功能化石墨烯，并報道其過氧化物酶樣活性[16]。功能雜化納米片形成了石墨烯與血紅素之間的p-p相互作用，表征了其固有的類過氧化物酶活性。

圖3 含血紅素的功能化石墨烯表現(xiàn)出過氧化物酶活性[16]Fig.3 Functionalized graphene containing heme exhibited peroxidase activity[16]

1.1.4 其他材料

除了以上介紹的三類，還有很多其他種類的納米酶。復合納米材料往往表現(xiàn)出類天然酶活性。Chen及其合作者在氧化石墨烯（GO）上合成了鉑納米顆粒，GO充當穩(wěn)定劑和還原劑[17]。得到的復合材料納米酶具有類過氧化物酶活性，被用于比色法檢測腫瘤細胞。Quan課題組將金納米顆粒修飾到了石墨烯表面，該復合材料納米酶具有類過氧化物酶活性，且活性比天然HPR要強，被用于檢測DNA[18]。Ju等運用膠束輔助法制備得到了FeS，F(xiàn)eS表現(xiàn)出較強的過氧化物酶活性，被應用于電流傳感器來檢測過氧化氫[19]。金屬有機框架（MOF）也是一類重要的納米酶。Zhao等合成的MIL-53(Fe)具有類過氧化物酶活性，被用于過氧化氫和葡萄糖的熒光檢測[20]。如圖4所示，Wei及其合作者將級聯(lián)催化劑hemin和葡萄糖氧化酶（GOX）組裝在ZIF-8上，使其具備了過氧化物酶和葡萄糖氧化酶雙酶活性，用于靈敏高效檢測葡萄糖[21]。

圖4 修飾了hemin和GOX的ZIF-8表現(xiàn)出雙酶活性[21]Fig.4 ZIF-8 modified with hemin and GOX exhibited dual enzyme activity[21]

1.2 納米酶活性分類

納米酶的一大特點是其具有多種酶樣催化活性，如過氧化物酶、過氧化氫酶、氧化酶、超氧化物歧化酶等。該章選取納米酶最常見的過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、氧化酶四類酶樣活性進行重點介紹。

1.2.1 過氧化物酶

過氧化物酶是指一類可催化過氧化物的天然酶的總稱，其在生物系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，如可以防御病原體和除去活性氧毒性等，在生命分析等領域已被廣泛應用。其中辣根過氧化物酶經(jīng)常被用于和抗體偶聯(lián)催化比色底物成像[22]。在目前納米酶的研究領域，類過氧化物酶活性的納米酶是被報道最多的，也是被研究應用最廣泛的。Wu等提出了一種易于制備的鉑納米粒子（PtNPs）探針，用于對汞離子的敏感和選擇性檢測[23]。他們制備了平均粒徑約為2.5 nm的表面覆蓋有檸檬酸鹽的PtNPs，表面的檸檬酸鹽可以吸附汞離子，大量汞離子被吸附后形成了汞齊，抑制了PtNPs的類過氧化物酶活性?；谶@一原理，利用檸檬酸封頭的PtNPs與TMB和H2O2的比色體系，建立了比色汞傳感器。一般來說，模擬過氧化物酶活性的納米酶的催化過程會產(chǎn)生自由基，并發(fā)生芬頓或者類芬頓反應。以Fe3O4納米酶為例，在此反應過程中，H2O2會首先吸附到納米酶表面，隨著鐵離子價態(tài)的變化，H2O2被活化，O-O鍵發(fā)生斷裂生成了兩個·OH。由于納米酶表面電子交換作用的存在，這些·OH會保持穩(wěn)定存在。此后，這些·OH能夠搶奪底物的電子并氧化底物，或通過多步反應生成其他類型自由基氧化底物[24]。金、鉑等納米顆粒的類過氧化物酶活性機理也可能與此類似[25]。

1.2.2 過氧化氫酶

過氧化氫酶是能夠催化H2O2生成氧氣和水的一種酶。研究發(fā)現(xiàn)，許多金屬材料乃至金屬氧化物都具有類過氧化氫酶樣活性，且這類納米酶往往還兼具其他類酶催化活性，比如過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性等[26-27]。這類酶表達何種酶活性，一般由其所處的微環(huán)境決定。比如同時具有類過氧化物酶和類過氧化氫酶活性的鉑納米酶。酸性條件下，其主要體現(xiàn)出類過氧化物酶活性，微環(huán)境呈中性或堿性時，則主要體現(xiàn)類過氧化氫酶活性[28]。納米酶具有類過氧化氫酶活性的原理一般被認為與納米酶結構相關。以Au納米顆粒為例，Gao等通過理論計算，推斷出H2O2在堿性條件下會轉移一個H給已經(jīng)吸附在材料表面的OH，這樣同時形成HO2和H2O，接著HO2中的H會轉移到另一個H2O2上，這樣最終形成了O2和H2O[29]。

1.2.3 超氧化物歧化酶

氧化物歧化酶（SOD）指的是能夠讓超氧自由基發(fā)生歧化反應,轉變?yōu)镠2O2和O2的酶。超氧自由基屬于一種常見的活性氧，過多積聚在體內會引發(fā)相關炎癥并導致組織損傷，而SOD可以除去超氧陰離子，保護機體不受相關損傷。天然SOD價格昂貴且穩(wěn)定性差，因此能可模擬SOD活性的納米酶成為了研究熱點。CeO2是最早見報的類SOD活性納米酶，除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)Co3O4、Mn2O3、富勒烯及其衍生物等都具有類SOD活性[30]。

1.2.4 氧化酶

天然氧化酶指能催化氧化劑氧化反應并生成H2O2或水的酶。2009年，Perez課題組首次報道了類氧化酶催化活性的納米酶。他們發(fā)現(xiàn)，酸性條件下納米氧化鈰能氧化TMB、多巴胺和2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸等一系列酶聯(lián)底物而不需要外加氧化劑[31]。此后，貴金屬納米顆粒、金屬硫化物、過渡態(tài)金屬氧化物等納米材料也被報道具有類氧化酶催化活性[32-34]。Rossi課題組發(fā)現(xiàn)，在O2存在下，金納米顆粒可以催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，具有葡萄糖氧化酶活性[35]。Tremel等合成了MoO3納米顆粒，具有類亞硫酸鹽氧化酶活性，能夠催化具有毒性的亞硫酸鹽氧化成為無毒的硫酸鹽[36]。

2 基于納米酶的生化傳感

在生化傳感領域，傳統(tǒng)的方法是比色法、熒光法和電化學檢測方法，這些傳統(tǒng)方法均通過構建信號傳導反應體系實施被檢測物的定量分析。其中，經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）利用天然酶的催化能力構建靈敏的反應體系，能達到精確的定量檢測效果。隨著納米酶的快速發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)某些具有酶樣活性的納米酶可高效催化一些底物的顯色反應，基于此發(fā)展了一批新型生化傳感器。至今為止，使用納米酶催化的生化傳感器已廣泛用于離子、小分子、生物大分子、癌細胞等物質的高精度檢測。

2.1 離子檢測

進入工業(yè)時代后，經(jīng)濟快速發(fā)展的同時人類付出了環(huán)境污染的代價，各類工業(yè)生產(chǎn)導致了大量的環(huán)境污染，其中包括金屬離子污染。許多金屬離子具有生物毒性，可通過消化道、呼吸道等多種途徑進入人體。人體長期攝入這些有害離子將導致慢性中毒，甚至危及生命。因此，發(fā)展準確快速的檢測飲用水及食物中重金屬離子濃度的方法具有現(xiàn)實意義。組氨酸修飾的金納米團簇（HisAuNCs）表現(xiàn)出較好的過氧化物酶樣活性，Guo等基于此發(fā)展了一種高選擇性檢測Cu2+的簡便方法[37]。金納米團簇（AuNCs）自身表現(xiàn)出一定的過氧化物酶樣活性，組氨酸在其表面的修飾可增強其與底物的結合能力，達到AuNCs的高催化活性。His-AuNCs可高效催化有機底物（如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）或2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS））和H2O2生成有色產(chǎn)物。Cu2+遇組氨酸表現(xiàn)出高親和力。在Cu2+存在下，His-AuNCs的過氧化物酶樣活性受到抑制。利用His-AuNCs可催化H2O2和有機底物（TMB）的能力，可通過對吸收信號變化的檢測達到高特異性及高靈敏度檢測Cu2+的效果。此外，納米酶被應用于對Ag+的檢測方法中。Ag+有抑菌能力，人類利用Ag+進行食物的保鮮消毒已有很長的歷史，現(xiàn)代社會中Ag+發(fā)揮了更大作用，常被用于進行飲用水的消毒及醫(yī)療設備的生產(chǎn)。但是由于Ag+的大量使用，每年地球產(chǎn)生的Ag+污染在2500噸以上。且大量Ag+流入地表水，由此造成的環(huán)境污染及經(jīng)濟損失無法估量。因此，在實際飲用水樣品中檢測Ag+具有重要意義。牛血清白蛋白穩(wěn)定的AuNCs有過氧化物酶模擬活性，可催化H2O2對TMB進行氧化。Ag+通過氧化還原反應可被AuNCs表面的Au0還原成Ag0，表現(xiàn)出Au@AgNCs的效果。由此得到一種與底物較難反應的復合納米材料，從而表現(xiàn)出AuNCs催化活性的降低。如圖5所示，基于上述原理，最近Tang等成功發(fā)展了一種新的Ag+比色檢測方案[38],檢測限達到0.204μmol/L，可用于分析實際水樣中Ag+含量。此外，納米酶還可被用于檢測一些劇毒物質，如非金屬物質氰化物離子（CN-）。Huang和Chang的研究小組開發(fā)了一種通過構建氫氧化鈷/氧化物改性的氧化石墨烯（CoOxH-GO）納米片比色檢測CN-的方法[39]。CoOxH-GO表現(xiàn)出過氧化物酶樣活性，當H2O2存在情況下，其可催化Amplex Red（AR）產(chǎn)生變色氧化。但是，CoOxHGO易與CN-結合形成Co（II）-氰化物配合物，這抑制了CoOxH-GO與底物之間的電子轉移，使得CoOxH-GO的酶樣催化活性受到抑制?；诖嗽順嫿ǖ募{米酶生化傳感器系統(tǒng)可用于水樣中CN-的靈敏檢測。

圖5 基于BSA@AuNCs過氧化物酶抑制的Ag+檢測法[38]Fig.5 Ag+detection method based on peroxidase inhibition of BSA@AuNCs[38]

2.2 小分子檢測

H2O2是不完全還原O2的產(chǎn)物，也是多種有機物的副產(chǎn)物，廣泛存在于一些細胞活動和信號傳遞活動中，常被用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、生物化學及環(huán)境保護領域。傳統(tǒng)的H2O2檢測方法主要為基于辣根過氧化物酶（HRP）的比色檢測策略。2010年，Qu和他的團隊成功地制備了羧基修飾的氧化石墨烯（GO-COOH）納米材料[40]。此GOCOOH納米材料具有高效的過氧化物酶樣活性，可催化H2O2氧化TMB生成藍色oxTMB。構建GO-COOH/TMB系統(tǒng)可實現(xiàn)H2O2的高靈敏檢測。如圖6所示，最近，Zhou等以金屬有機骨架（MIL-101）為模板，成功開發(fā)了AuNPs@MIL-101@oxidases納米酶[41]。組裝葡萄糖氧化酶后，所得材料可催化葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2。在存在金納米組分的情況下，生成的H2O2可以將白孔雀綠（拉曼惰性報告分子）氧化為活性孔雀綠（MG）。由于MG表現(xiàn)出高拉曼信號，因此可以利用拉曼信號的變化，使用AuNPs@MIL-101@GOx納米酶體外檢測活體大腦中的小分子葡萄糖。谷胱甘肽（GSH）是一種內源性生物硫醇，普遍存在于生命體內的氧化還原平衡、信號傳遞及基因調控等諸多生理活動中。Dyson等利用納米酶構建了一種有效檢測GSH水平的比色方法[42]。他們選擇MnO2納米片模擬過氧化物酶，通過MnO2納米酶催化H2O2，氧化TMB產(chǎn)生oxTMB，產(chǎn)生明顯的變色反應。GSH具有強還原性，可分解MnO2納米片并還原oxTMB，通過對反應體系650 nm處的紫外吸光度變化值的檢測可評估GSH水平。除上述分子外，納米酶還可以用于檢測其他分子，例如多巴胺[43]，尿素[44]，抗壞血酸[45]，卡地地洛[46]，磷酸鹽[47]等。

圖6 表面增強拉曼散射結合AuNPs@MIL-101@oxidases納米酶，用于監(jiān)測生物樣品中的葡萄糖[41]Fig.6 Surface-enhanced Raman scattering combined with AuNPs@MIL-101@oxidases nanozymes for monitoring glucose in biological samples[41]

2.3 生物大分子檢測

納米酶可用于大分子蛋白質檢測。如利用納米酶比色傳感平臺對乙酰膽堿酯酶（AChE）的檢測。AChE是一種在神經(jīng)系統(tǒng)信息傳導中起重要作用的蛋白質。AChE的活性功能與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關，如阿茲海默癥（AD）和帕金森氏?。≒D）。因此，發(fā)展AChE的檢測方法有重要價值。如圖7所示，Lin等利用MnO2納米片固有的過氧化物酶樣活性開發(fā)了一種AChE活性定量檢測的新型比色傳感平臺[48]。MnO2可以催化TMB形成在H2O2存在下，在650 nm處具有明顯的吸光度的oxTMB形成。AChE可以催化乙酰基硫代膽堿的水解生成硫代膽堿，硫代膽堿能夠分解MnO2納米片，導致MnO2的酶樣催化性能下降?；诖嗽?，可以通過監(jiān)測oxTMB的吸光度變化來測量AChE活性。

圖7 基于MnO2納米片過氧化物酶樣活性檢測AChE活性[48]Fig.7 Detection of AChE activity based on peroxidase-like activity of MnO2 nanosheets[48]

2.4 癌細胞檢測

作為人類健康領域最大的敵人之一，癌癥每年奪去數(shù)百萬人的生命。但遺憾的是，目前人類對癌癥的認識仍然比較淺顯，對癌癥的研究仍然具有重要價值。Perez等發(fā)現(xiàn)CeO2納米顆粒在酸性條件下表現(xiàn)出氧化酶樣活性，可催化許多有機底物的氧化反應。利用這種獨特的性能，他們構建了葉酸偶聯(lián)的CeO2納米體系用于免疫法檢測癌細胞[49]。葉酸可以選擇性識別過度表達葉酸受體的癌細胞，利用葉酸偶聯(lián)的CeO2納米體系結合CeO2/TMB系統(tǒng)，可實現(xiàn)癌細胞的比色檢測。受Perez工作的啟發(fā)，屈和任的團隊進行了進一步的探索。如圖8所示，在他們的工作中，制備了葉酸（FA）共軛氧化石墨烯-金納米簇（FA-GOAuNCs）納米探針用于比色檢測癌細胞[50]。根據(jù)他們的方案，氧化石墨烯（GO）作為載體，溶菌酶穩(wěn)定的AuNCs通過靜電作用吸附在GO表面。最后得到的GO-AuNCs表現(xiàn)出寬pH范圍內優(yōu)異的過氧化物酶樣活性。將FA修飾在GO-AuNCs表面后，由于癌細胞表面有葉酸受體存在，F(xiàn)AGO-AuNCs納米復合材料可以通過對其識別進行癌細胞檢測。

圖8 FA-GO-AuNCs納米探針用于癌細胞比色檢測[50]Fig.8 Colorimetric detection of cancer cells based on FA-GO-AuNCsnanoprobe[50]

3 結論與展望

作為天然酶的潛在替代物，納米酶憑借自身催化穩(wěn)定性高、易制備、成本低等優(yōu)勢，吸引了廣泛關注與研究，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種不同材料與催化活性的納米酶，這些納米酶易于大規(guī)模制備、適用于復雜環(huán)境、不易失活，在生化傳感領域有著廣泛的應用前景。當然，納米酶還存在著一些短板，比如酶活性的多樣性還有待進一步拓展、在催化效率方面與天然酶存在一定差距等。但納米酶從被發(fā)現(xiàn)至今才短短十幾年，是一個很年輕的領域，有著巨大的潛力和許多未知數(shù)等著人們去探索。因此相信未來納米酶的發(fā)展將會是極其迅速的，各種催化效率更強、穩(wěn)定性更好、酶活性更豐富的納米酶將會被研發(fā)出來，在生化傳感領域發(fā)揮更大的作用。