王桃紅，張少博，張會(huì)敏，趙光躍，李學(xué)民，魏玉海，崔宗巖,

（1.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004；2.西寧海關(guān)技術(shù)中心，青海 西寧 810001）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜味物質(zhì)[1]。蜂蜜具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人們?nèi)粘ＯM(fèi)的主要食品之一。蕎麥蜜以蕎麥為蜜源植物，含有較多的礦質(zhì)元素[2]和酚類物質(zhì)[3]等成分，具有抗菌[4]和抗氧化活性[5]，對(duì)治療結(jié)腸炎和調(diào)節(jié)胃腸道功能有一定的效果[2]。蜂蜜風(fēng)味是衡量蜂蜜品質(zhì)的重要指標(biāo)，主要與揮發(fā)性成分有關(guān)。揮發(fā)性物質(zhì)除與蜂蜜種類[6]、釀造蜂種[7]有關(guān)外，還會(huì)受到加工工藝[8]、貯存條件和蜂蜜品質(zhì)的影響，已有研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜發(fā)酵會(huì)使揮發(fā)性成分發(fā)生變化[9-10]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蕎麥蜜揮發(fā)性成分的研究較少。孫雨安等[11]測(cè)定了洋槐、荊條、棗花、椴樹、蕎麥等蜂蜜中揮發(fā)性成分，指出蕎麥蜜中順式-9-二十三烯含量遠(yuǎn)高于棗花蜜。Pasini等[12]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)在蕎麥蜜中共檢測(cè)出100 種揮發(fā)性成分，其中3-甲基丁酸為蕎麥蜜主要揮發(fā)性成分。Panseri等[13]研究了意大利阿爾卑斯地區(qū)的蕎麥蜜中揮發(fā)性成分和花粉來(lái)源的關(guān)系。Plutowska等[14]發(fā)現(xiàn)波蘭蕎麥蜜中特征揮發(fā)性成分為2-甲基丁醛和3-甲基丁醛。由于儀器條件和樣品量的限制，對(duì)蕎麥蜜揮發(fā)性成分缺乏全面的測(cè)定與分析，所以，建立有效的方法對(duì)蕎麥蜜揮發(fā)性成分進(jìn)行系統(tǒng)的分析顯得很有必要。

目前，應(yīng)用較廣泛的揮發(fā)性成分提取方法主要有SPME法[15-17]、超聲波輔助萃取法[18-19]、同時(shí)蒸餾萃取法[20]、固相萃取法[21]和溶劑萃取法[22]等。SPME作為一項(xiàng)新型的萃取方法，以其檢測(cè)時(shí)間短、不引入萃取溶劑污染樣品、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于蜂蜜揮發(fā)性成分的分析測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)利用HS-SPME-GC-MS法對(duì)中國(guó)產(chǎn)區(qū)的14 批蕎麥蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，系統(tǒng)分析揮發(fā)性成分的組成種類和含量，比較分析不同成熟度蕎麥蜜揮發(fā)性成分的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 蜂蜜樣品

實(shí)驗(yàn)所用蕎麥蜜樣品均于2017—2018年采自內(nèi)蒙古地區(qū)。樣品采集后在檢測(cè)前置于－20 ℃條件下保存。詳細(xì)信息見表1。

表1 蕎麥蜜樣品采集信息Table 1 Information about the collected buckwheat honey samples

1.1.2 試劑

乙醇、2-甲基丁醇標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；20 mL頂空瓶（配制硅膠/聚四氟乙烯隔墊和20 mm鐵蓋） 德國(guó)Gerstel公司；壓蓋器和啟蓋器 美國(guó)CNW公司；7890B-5977B型GC-MS聯(lián)用儀（配制分流/不分流進(jìn)樣口和SPME專用襯管）、DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司；MPS多功能樣品前處理平臺(tái)（配制自動(dòng)化HS-SPME手柄）德國(guó)Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取（2.0±0.1）g蜂蜜樣品于20 mL頂空瓶中，密封后置于樣品前處理平臺(tái)上進(jìn)行SPME。

1.3.2 SPME條件

萃取纖維選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS，實(shí)驗(yàn)前在270 ℃條件下老化30 min，萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間45 min，平衡時(shí)間10 min，振蕩速率250 r/min，進(jìn)樣口解吸時(shí)間5 min。

1.3.3 GC-MS條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度270 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣為高純氦，流量1.0 mL/min；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃保持3 min，以3 ℃/min升溫至160 ℃，然后以10 ℃/min升溫至270 ℃，保持6 min，總運(yùn)行時(shí)間為60 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度270 ℃；數(shù)據(jù)采集方式：全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z25～450。選擇離子模式，乙醇定量離子m/z31，定性離子m/z45、29、46，其豐度比為100∶51∶30∶22，2-甲基丁醇的定量離子為m/z57，定性離子為m/z41、56、70，其豐度比為100∶88∶88∶42。

1.3.4 定性方法

本研究主要采用如下2 種方法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性：

NIST庫(kù)檢索：判定目標(biāo)化合物時(shí)，將目標(biāo)色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖扣除背景空白后，進(jìn)行NIST 14譜庫(kù)檢索，正相和反相匹配度均在800以上，且相似度得分值最高的化合物，即認(rèn)定為目標(biāo)物，因色譜柱固定相流失帶來(lái)的硅氧烷類化合物，不計(jì)在內(nèi)。

保留指數(shù)定性：保留指數(shù)主要表示待測(cè)的目標(biāo)物質(zhì)在固定相上的保留行為，它與固定相的性質(zhì)有關(guān)[23]。雖然GC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜的分離能力強(qiáng)和質(zhì)譜的鑒別能力高的特點(diǎn)，提高了化合物定性的高效性和準(zhǔn)確性，但由于部分化合物具有同分異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)極為相似，其質(zhì)譜圖差異不大，僅通過(guò)NIST譜庫(kù)檢索經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)因化合物得分相似而導(dǎo)致定性結(jié)果出現(xiàn)偏差。在這種情況下，利用保留指數(shù)可提高判斷的準(zhǔn)確性。

1.3.5 定量方法

采用面積歸一化法對(duì)蜂蜜中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)GC-MS總離子流色譜圖中目標(biāo)峰進(jìn)行積分和計(jì)算峰面積，每個(gè)目標(biāo)峰的面積與總峰面積之比，即為該目標(biāo)物的相對(duì)含量。未準(zhǔn)確定性的化合物標(biāo)記為未知峰，柱流失帶來(lái)的色譜峰不計(jì)在目標(biāo)峰內(nèi)。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)特征化合物乙醇和2-甲基丁醇進(jìn)行絕對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

圖1 VF-624和DB-5MS色譜柱對(duì)總峰面積和總峰數(shù)量的影響Fig. 1 Effect of chromatographic columns VF-624 and DB-5MS on peak area and number

色譜柱的選擇直接影響檢測(cè)到目標(biāo)物的種類和數(shù)量，也會(huì)對(duì)目標(biāo)物的檢出限產(chǎn)生影響[24]。本研究對(duì)揮發(fā)性成分檢測(cè)常用的DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）和VF-624（60 m×0.25 mm，1.4 μm）色譜柱進(jìn)行對(duì)比分析。如圖1所示，DB-5MS色譜柱相對(duì)于VF-624色譜柱，在檢測(cè)目標(biāo)物的響應(yīng)以及目標(biāo)峰的數(shù)量上，均具有明顯優(yōu)勢(shì)，因而實(shí)驗(yàn)選擇DB-5MS色譜柱用于蕎麥蜜中揮發(fā)性成分分離測(cè)定。

2.1.2 升溫程序的選擇

在GC-MS檢測(cè)過(guò)程中，影響目標(biāo)物分離效果和峰形的因素不僅包括進(jìn)樣口溫度、檢測(cè)器溫度和柱溫[24]，升溫程序也直接影響著目標(biāo)物色譜峰的保留時(shí)間和分離效果[25]?？疾焐郎爻绦?（初始溫度50 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min速率升至200 ℃，然后以10 ℃/min速率升至270 ℃，保持7 min）和升溫程序2（初始溫度40 ℃，保持3 min，然后以3 ℃/min速率升至160 ℃，然后以10 ℃/min速率升至270 ℃，保持6 min）對(duì)揮發(fā)性成分測(cè)定的影響，結(jié)果如圖2所示。不同升溫程序?qū)]發(fā)性成分的總峰面積影響不大。由于分析時(shí)間越長(zhǎng)，化合物色譜峰分離度越好，所以升溫程序2的總峰數(shù)量較高。綜上考慮，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選擇升溫程序2。

圖2 升溫程序?qū)偡迕娣e和總峰數(shù)量的影響Fig. 2 Effect of rising temperature programs on peak area and number

2.2 SPME參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 萃取纖維的選擇

圖3 萃取纖維對(duì)總峰面積和總峰數(shù)量的影響Fig. 3 Effect of extraction fiber coatings on peak area and number

SPME的萃取頭涂有極性不同的固定相或吸附劑，用極性相匹配的涂層可減少萃取雜質(zhì)的干擾、提高萃取選擇性等[26]。萃取纖維的選擇直接決定了萃取目標(biāo)物的種類和數(shù)量?？疾斐Ｓ玫?0/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS和65 μm PDMS/DVB 4 種不同涂層的萃取頭對(duì)蕎麥蜜揮發(fā)性成分萃取效果的影響，如圖3所示。DVB/CAR/PDMS和PDMS/DVB纖維對(duì)蜂蜜揮發(fā)性成分萃取的種類和數(shù)量要明顯多于另外2 種纖維，與Ceballos[27]和Pérez[28]等報(bào)道一致。由于DVB/CAR/PDMS較PDMS/DVB纖維吸附揮發(fā)性成分的極性范圍更廣，在蜂蜜中揮發(fā)性成分的研究中應(yīng)用更為廣泛，因而本研究選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維。

2.2.2 萃取溫度的選擇

HS-SPME體系為氣、液、固三相體系[27]，適當(dāng)升高萃取溫度，可以加快分子運(yùn)動(dòng)，縮短分析物組分在三相間達(dá)到分配平衡的時(shí)間，提高萃取效率，從而提高分析效率和靈敏度[8]。然而當(dāng)溫度升的過(guò)高，也會(huì)使一些揮發(fā)性成分從吸附涂層上脫附，影響SPME的萃取效果，此外，溫度過(guò)高會(huì)使蜂蜜中部分物質(zhì)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，例如，超過(guò)70 ℃羥甲基糠醛含量會(huì)升高[29]，所以選擇合適的萃取溫度至關(guān)重要?？疾燧腿囟?0、40、50、60、70 ℃條件下樣品中揮發(fā)性成分的萃取效果。如圖4所示，在萃取溫度不超過(guò)60 ℃條件下，隨著萃取溫度的升高，揮發(fā)性成分色譜峰的總面積和總數(shù)量逐漸增多，萃取60 ℃和70 ℃條件下目標(biāo)峰數(shù)量變化不大，但峰響應(yīng)值降低。結(jié)合溫度過(guò)高會(huì)使蜂蜜中部分揮發(fā)性成分發(fā)生變化的情況，實(shí)驗(yàn)選擇萃取溫度60 ℃。

圖4 萃取溫度對(duì)總峰面積和總峰數(shù)量的影響Fig. 4 Effect of extraction temperature on peak area and number

2.2.3 萃取時(shí)間的選擇

圖5 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積和總峰數(shù)量的影響Fig. 5 Effect of extraction time on peak area and number

萃取時(shí)間一般指檢測(cè)分析物在樣品和涂層之間達(dá)到分配平衡所需要的時(shí)間[30]。在蜂蜜揮發(fā)性成分萃取過(guò)程中，萃取時(shí)間與蜂蜜樣品基質(zhì)、樣品體積、不同萃取頭性質(zhì)等因素協(xié)同作用而達(dá)到萃取平衡[8]?？疾燧腿r(shí)間分別為15、30、45、60、75 min條件下樣品中揮發(fā)性成分的萃取效果，見圖5。在萃取時(shí)間不超過(guò)45 min條件下，隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分揮發(fā)性成分的色譜峰總面積和總數(shù)量逐漸增多，但當(dāng)萃取時(shí)間再延長(zhǎng)至60 min或75 min時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)值變化不大，但目標(biāo)峰數(shù)量略有減少，主要是因?yàn)樵谶_(dá)到吸附平衡后，萃取纖維頭上的某些揮發(fā)性成分發(fā)生解吸造成[8,31]。所以選取萃取時(shí)間45 min。

2.3 蕎麥蜜中揮發(fā)性成分分析

利用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定蕎麥蜜中的揮發(fā)性成分，如圖6所示。由表2所示，所有蕎麥蜜樣品共檢測(cè)出168 種揮發(fā)性成分，其中所有樣品的共有物質(zhì)120 種，主要包括醇類、芳香族類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷烴類、酯類等，另外有20 個(gè)目標(biāo)峰未鑒定出具體化合物種類（標(biāo)記為未知峰）。這些物質(zhì)共同構(gòu)成了蕎麥蜜獨(dú)特的揮發(fā)性成分體系，同時(shí)賦予蕎麥蜜獨(dú)特的風(fēng)味。

圖6 蕎麥蜜揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 6 Total ion current chromatograms of volatile components in buckwheat honey

在蜂蜜采收過(guò)程中，封蓋的成熟蜜僅需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的加熱過(guò)濾工序即可保存銷售，極大程度上防止了營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的損失[32-33]，但水分含量較高的未成熟蜂蜜則需要脫水濃縮加工才能長(zhǎng)期保存。一般蜂蜜的成熟度可按波美度的大小衡量。本研究采集在35～42 °Bé的蕎麥蜜共14 個(gè)樣品，對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行比較分析。由圖7可以看出，不同成熟度蕎麥蜜揮發(fā)性成分存在顯著差異，推測(cè)與波美度存在一定的關(guān)系，因而后續(xù)分析中將樣品分為2 組：即A組（40 °Bé以下，代表成熟度較差的蕎麥蜜樣品）和B組（40 °Bé以上，代表成熟度較好的蕎麥蜜樣品），分別包含7 個(gè)樣品。

圖7 蕎麥蜜蜂蜜樣品中揮發(fā)性成分種類Fig. 7 Relative contents of various classes of volatile components in buckwheat honey samples

A組共測(cè)定出149 種物質(zhì)，主要包括酯類、醇類、醛類和酸類等。其中，相對(duì)含量較高的物質(zhì)為醇類、酯類，二者占總含量的74.35%，其中酯類化合物種類最多，為41 種，相對(duì)含量占比為39.76%，醇類物質(zhì)共16 種，相對(duì)含量?jī)H次于酯類物質(zhì)，占總含量的34.59%，酯類和醇類是構(gòu)成A組蕎麥蜜風(fēng)味的主要物質(zhì)。在A組蕎麥蜜中，相對(duì)含量最高的酯類物質(zhì)為醋酸苯乙酯和3-甲基丁酸乙酯，分別占總含量的16.88%和6.91%，相對(duì)含量最高的醇類物質(zhì)為乙醇，占總含量的19.16%，這3 種物質(zhì)是A組蕎麥蜜的主要揮發(fā)性成分。

表2 蕎麥蜜中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量Table 2 Relative abundances of volatile compounds in buckwheat honeys

續(xù)表2 %

續(xù)表2 %

B組共檢測(cè)出139 種揮發(fā)性成分，主要包括醛類、酸類、酮類、醇類和芳香類等物質(zhì)。其中，醛類和酸類物質(zhì)含量較高，占總含量的62.36%。其中醛類物質(zhì)含量占比最高，為42.50%，該結(jié)果與Vilma等[34]發(fā)現(xiàn)的醛類是蜂蜜風(fēng)味的主要來(lái)源物質(zhì)一致。酸類物質(zhì)在B組蕎麥蜜中的含量和種類也較多，為19.86%，共15 種。其中含量最高的醛類物質(zhì)為糠醛，占總含量的24.13%，酸類物質(zhì)最高的為2-甲基丁酸，占總含量的7.90%。

對(duì)蕎麥蜜樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行整體分析，發(fā)現(xiàn)2-甲基丁酸在所有蕎麥蜜中存在且含量較高，與Panseri等[13]的報(bào)道一致，推測(cè)2-甲基丁酸是蕎麥蜜的特征揮發(fā)性成分。Zhou Qiaoxuan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，英國(guó)和美國(guó)蕎麥蜜中主要揮發(fā)性成分為3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、苯乙醛、香草醛、甲酚和香豆素等，本研究發(fā)現(xiàn)，苯乙醛在所有樣品中有檢出，3-甲基丁醛在大部分樣品中均有檢出，但2,3-丁二酮、香豆素和香草醛等在樣品中未被檢出，推測(cè)可能是由于地域不同所致。該結(jié)果表明，蕎麥蜜揮發(fā)性的測(cè)定可以作為其產(chǎn)地區(qū)分鑒別的一種技術(shù)手段。

2.4 不同成熟度蕎麥蜜的揮發(fā)性成分對(duì)比分析

圖8 不同成熟度的蕎麥蜜中差異揮發(fā)性成分Fig. 8 Differences in volatile compounds of buckwheat honeys with different maturity levels

通過(guò)對(duì)蕎麥蜜中揮發(fā)性成分進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)不同成熟度蕎麥蜜中存在顯著差異的物質(zhì)，其中差異較大的代表性物質(zhì)含量對(duì)比結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，2-甲基-1-丙醇只在A組樣品中被檢測(cè)出，而乙醇、醋酸苯乙酯、壬醇、丙酸乙酯、2-甲基丁醇在A組蕎麥蜜中相對(duì)含量較高，分別為B組蕎麥蜜的4.8、31、5.8、8.8、5.1 倍，推測(cè)是由于成熟度低的蕎麥蜜中酵母菌的存在，蜂蜜中的碳水化合物發(fā)酵致使酯類和醇類物質(zhì)含量升高[9]。

圖9 乙醇（A）和2-甲基丁醇（B）與波美度相關(guān)性Fig. 9 Correlations of Baume degree with ethanol (A) and 2-methyl-1-butanol (B)

進(jìn)一步分析代表性差異成分含量與波美度的相關(guān)性，結(jié)果如圖9所示。發(fā)現(xiàn)乙醇和2-甲基丁醇的含量與波美度之間存在一定的負(fù)相關(guān)。隨著波美度的增加，乙醇和2-甲基丁醇的含量整體呈遞減的趨勢(shì)，其相關(guān)系數(shù)（R2）分別達(dá)到0.90和0.87。據(jù)此說(shuō)明，乙醇和2-甲基丁醇可以作為指示蕎麥蜜成熟度的標(biāo)志物，其含量越高，則說(shuō)明蕎麥蜜成熟度越差。進(jìn)一步對(duì)乙醇和2-甲基丁醇的含量進(jìn)行絕對(duì)定量，如表3所示。測(cè)定結(jié)果和相對(duì)含量的趨勢(shì)一致，隨著波美度的下降，乙醇和2-甲基丁醇的含量呈現(xiàn)整體增加的趨勢(shì)，該結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)蕎麥蜜揮發(fā)性成分的測(cè)定，了解其特征物質(zhì)含量，可以為蜂蜜的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一定的借鑒參考。

表3 蕎麥蜜中乙醇和2-甲基丁醇含量Table 3 Contents of ethanol and 1-butanol, -2-methyl in buckwheat honeys at different maturity levels

3 結(jié) 論

本研究建立HS-SPME-GC-MS法測(cè)定蜂蜜中的揮發(fā)性成分，并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)中國(guó)產(chǎn)區(qū)14 批不同成熟度的蕎麥蜜揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定。所有樣品中共檢測(cè)出168 種物質(zhì)，通過(guò)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)不同成熟度的蕎麥蜜揮發(fā)性成分存在明顯差異。低成熟度蕎麥蜜的主要揮發(fā)性成分為酯類和醇類，而構(gòu)成高成熟度蕎麥蜜揮發(fā)性體系的主要物質(zhì)為醛類和酸類。研究發(fā)現(xiàn)2-甲基丙醇只在低成熟度蕎麥蜜中出現(xiàn)，乙醇、醋酸苯乙酯、壬醇、丙酸乙酯、2-甲基丁醇在低成熟度蕎麥蜜中含量明顯高于高成熟度蕎麥蜜，而且乙醇和2-甲基丁醇的含量與波美度之間存明顯的負(fù)相關(guān)性。結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)蕎麥蜜揮發(fā)性成分的測(cè)定，可以為蜂蜜的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一定的借鑒參考。