廖太陽，王培民，茆 軍，丁 亮，梅 偉，張 力，李曉辰，吳 鵬，徐 波，張皞晟

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)屬于痹癥范疇，包括“痛痹”、“膝痹”和“骨痹”等，主要病理特征為滑膜炎癥、軟骨破壞、軟骨下骨病變，造成長期慢性疼痛，最終可導致膝關節(jié)活動受限甚至殘疾不得不行關節(jié)置換，給工作和生活造成嚴重影響[1]。目前，KOA的發(fā)病機制尚未明確，一項針對KOA的非手術指南中指出，其發(fā)病可能與生物力學改變，基質金屬蛋白酶(MPP)激活活化，炎癥因子分泌，軟骨、軟骨下骨和滑膜病變等相關，提出五級治療和干預方案[2]。關節(jié)軟骨內無血管和神經組織，營養(yǎng)和氧氣必須從滑液和軟骨下骨擴散獲得，故探究缺氧對人關節(jié)軟骨的機制及作用就顯得十分重要。近些年來，膝關節(jié)腔內缺氧及缺氧誘導因子(HIF)的作用受到廣泛關注，其中HIF-1在軟骨組織中具有關鍵作用，是維持骨關節(jié)炎軟骨穩(wěn)態(tài)的重要因素。本文就HIF在KOA發(fā)病機制中作用綜述如下。

1 HIF信號通路

1.1HIF概述 HIF是由兩個不同亞基聚合成的異源蛋白二聚體：不穩(wěn)定缺氧調節(jié)的α亞基(HIF-α，分子量120 kD)和穩(wěn)定氧不敏感的β亞基(HIF-β,分子量91～94 kD)，HIF-β也被稱為芳香烴受體核轉運體(ARNT)[3]。到目前為止，已經描述了人類HIF-α蛋白家族的3個成員：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。HIF-1α在缺氧的關節(jié)軟骨中起重要作用，對維持關節(jié)軟骨基質有保護作用，HIF-2α對關節(jié)軟骨有不良影響(軟骨破壞及軟骨細胞死亡)，HIF-3α可能是HIF-1α和HIF-2α的靶基因，起負調控作用[4]。

1.2HIF調節(jié)機制 HIF-α蛋白表達和活性水平在常氧和缺氧狀態(tài)下有所不同，正常氧濃度下極難檢測到HIF-1α表達，而低氧(氧濃度為5%)時，HIF-1α可在細胞中檢測到較高蛋白表達水平，在常氧(氧濃度為21%)和中度高氧(氧濃度為30%)HIF-1α蛋白表達較少甚至無表達[5]。脯氨酸羥基酶(PHD)和天冬氨酸羥基化酶(FIH)在對 HIF-α的調節(jié)中發(fā)揮了至關重要的作用。FIH是HIF-α的抑制因子，它通過特異性地對HIF-1α亞基 C-末端反式激活結構域(TAD-C) 第803位天冬酰胺殘基(Asn)羥基化，從而干擾HIF-1α與其轉錄輔助激活因子p300/CBP的結合。在常氧條件下，HIF-α(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)在富含絲氨酸(Ser)-脯氨酸(Pro)-蘇氨酸(Thr)的氧依賴降解結構域(ODDD)中發(fā)生不同程度的羥基化，其中HIF-α兩個處在關鍵位置的蛋白被PHD進行羥基化修飾，接著被腫瘤抑制因子(VHL)所識別和結合，然后通過泛素化通路，最終 HIF-α經蛋白酶體途徑被降解[6-8]。在缺氧條件下，PHD和FIH活力均下降，HIF泛素化羥基化過程受阻，蛋白酶體信號通路被抑制，在細胞質內降解受阻而穩(wěn)定性和活性增加，HIF-α大量聚集、積累并活化，從胞漿進入胞核內并與結構化結構亞基 HIF-1β及轉錄輔助激活因子p300/CBP發(fā)生聚合形成異二聚體[9]，然后分別與各自靶基因啟動子區(qū)域上的缺氧應答元件(HRE)結合，最終引發(fā)下游有關基因激活和轉錄[6,10]。

此外，HIF-α的蛋白水平及轉錄活性還受到許多炎性和生長因子表達的影響，如白細胞介素(IL)-1β、血管內皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α[11]?，F(xiàn)如今有研究表明，通過招募轉錄共激活因子(作用為促進基因表達)，HIF調節(jié)不同過程的基因表達，這些基因表達后參與了細胞的生長、增殖、遷移和凋亡，還有血管生成，糖的能量代謝，核苷氨基酸代謝等，使機體和組織適應缺氧，維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[12]。

2 缺氧對KOA發(fā)病機制影響

2.1缺氧與滑膜炎癥 滑膜炎癥是骨性關節(jié)炎的特征，現(xiàn)在已經被廣泛接受，并且骨性關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展與炎癥反應密切相關，甚至在疾病的早期滑膜病變就先一步顯現(xiàn)[13]。此外，在骨性關節(jié)炎患者的滑膜液中可檢測到IL、干擾素(IFN)、CXC基序配體趨化因子(CXCL)、生長因子、炎性細胞因子和其他炎性介質[14]。研究表明，HIF 是骨性關節(jié)炎滑膜炎癥的重要影響因素，骨性關節(jié)炎患者滑膜液中的HIF-1α濃度升高，且滑膜液和軟骨中HIF-1α的水平與疾病的嚴重程度和關節(jié)損傷密切相關[15]。

滑膜組織分泌產生了大量的關節(jié)滑液，滑膜積液是關節(jié)滑膜炎的特征之一，滑膜組織發(fā)生病變也常常影響到正常關節(jié)軟骨功能。在患者關節(jié)內常發(fā)現(xiàn)滑膜組織的增生、纖維化和血管形成，因為滑膜內血管生成的速度比滑膜增生的速度要慢，使滑膜氧供不足，滑膜液中氧分壓降低，軟骨可獲得的氧減少，關節(jié)腔內缺氧嚴重，這一系列改變對細胞外基質的新陳代謝造成不利影響。有學者通過HIF-1α基因敲除等技術證明抑制HIF-1α和糖酵解會誘導人滑膜成纖維細胞凋亡，HIF-1α沉默則降低體內滑膜活力[16]。段鑫[17]取人骨關節(jié)炎滑膜組織進行HE、免疫組織化學、CD34染色及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)等，結果表明骨性關節(jié)炎患者滑膜中HIF-1α及VEGF表達顯著升高，關節(jié)在發(fā)生退變、炎癥及創(chuàng)傷等應激損害情況下,滑膜組織均發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達增高且與VEGF有顯著相關性,推出HIF-1α在骨性關節(jié)炎滑膜炎中具有促進滑膜增生、繁殖和血管增生的作用。向靜[18]對兔左膝關節(jié)伸直位石膏固定進行KOA造模，觀察滑膜病理切片并進行免疫組織化學檢查等，發(fā)現(xiàn)HIF-1α和 VEGF 在滑膜中表達升高，且與 KOA 的嚴重程度呈正相關，VEGF在 KOA 的發(fā)生和發(fā)展中受 HIF-1α的調控。有研究指出，KOA中滑膜組織處于缺氧狀態(tài)并引起HIF-1α升高，升高的HIF-1α誘導成纖維樣滑膜細胞焦亡,成纖維樣滑膜細胞焦亡會加劇滑膜纖維化的病程進展，將滑膜組織HIF變化與焦亡纖維化聯(lián)系起來，為進一步探究骨關節(jié)炎滑膜與缺氧的機制開拓了思維[19-20]。

有趣的是目前HIF在KOA滑膜的研究較少，HIF在骨性關節(jié)炎的研究有待于進一步深入挖掘。我們知道HIF-1α與HIF-2α結構相似，作用不同，二者似乎是互相拮抗共同維持膝關節(jié)缺氧環(huán)境。HIF-1α在骨性關節(jié)炎滑膜深一層表達，而HIF-2α則在襯里表層高表達，二者的作用機制與位置深淺是否存在關聯(lián)？另外，筆者發(fā)現(xiàn)目前國內對于骨性關節(jié)炎滑膜HIF-1α變化仍停留在與VEGF及MMP關系的簡單研究，其分子作用機制仍需進一步探究，而關于HIF-2α在骨關節(jié)炎滑膜病變的研究似乎有待完善，其是否可以作為針對KOA治療的新靶點仍未可知，如HIF-2α是否可以介導骨性關節(jié)炎炎性因子釋放，導致滑膜的增生，與HIF-1α協(xié)同在KOA通過何種方式起怎樣的作用？

2.2缺氧與軟骨破壞 軟骨破壞是KOA嚴重的病理改變，最終結果將造成關節(jié)受損導致殘疾。關節(jié)軟骨由一種細胞類型的軟骨細胞組成，是一種無神經血管的結締組織，并被包裹在細胞外基質(ECM)中，這些特定的細胞約占軟骨總體積的1%，并負責基質的組成和完整性，從而賦予軟骨機械支持和關節(jié)潤滑的功能[21]。軟骨ECM是由水、Ⅱ型膠原蛋白(大部分)、蛋白聚糖(PG)和部分親水性大分子組成。由于關節(jié)軟骨沒有血管，故必須依靠從關節(jié)表面擴散來進行營養(yǎng)和代謝物交換。因此，細胞的整個新陳代謝都適合在低氧張力下運行。骨性關節(jié)炎發(fā)病機制中的軟骨破壞不僅與ECM的喪失有關，而且與軟骨細胞的死亡有關。

Coimbra等[22]通過免疫印跡和Northern雜交等技術第1次證明了HIF-1α和 HIF-2α在人膝關節(jié)軟骨中的表達，檢測正常人和KOA膝關節(jié)軟骨的軟骨細胞，結果發(fā)現(xiàn)HIF-1α在常氧(氧濃度21%)下培養(yǎng)的正常人和KOA關節(jié)軟骨細胞中表達,低氧條件下(氧濃度1%)培養(yǎng)的正常人和KOA關節(jié)軟骨細胞中觀察到 HIF-1α表達增加。Yang等[23]和Zhu等[24]表明缺氧條件增強了細胞HIF-1α的表達和活性。Kovács等[25]指出缺氧在軟骨細胞中起著雙重作用，它主要激活HIF-1α，從而促進基質合成，使RunX2(一種相關轉錄因子)和Wnt沉默。但是，在存在促炎性細胞因子的情況下，低氧條件會開啟HIF-2α，從而增強VEGF、MMP-13和異常膠原蛋白的表達，并引起ECM的降解。

HIF-1α通過調節(jié)低氧前軟骨細胞中SOX9的表達來調節(jié)軟骨的形成[26]。在軟骨組織工程中，HIF-1α也顯示出其軟骨形成能力；過表達的HIF-1α即使不使用外源性生長因子，也能促進和維持人軟骨細胞表型[27]。除此之外，骨性關節(jié)炎患者因軟骨基質破壞導致軟骨損傷，HIF參與了這一病理過程。有學者指出HIF-1α代謝控制軟骨細胞中膠原蛋白的合成和修飾，維持無氧糖酵解，使軟骨基質更耐蛋白酶介導的降解，從而增加了骨量，而HIF-1α信號傳導延長會干擾細胞的生物能和生物合成，從而導致骨骼發(fā)育異常[28]。Yudoh等[29]經檢測常氧和低氧培養(yǎng)下軟骨細胞上清液中糖胺聚糖(GAG)值分析測試HIF-1α介導的改變是否影響軟骨細胞中產生基質蛋白的潛力，發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，HIF-1α缺乏的軟骨細胞中的GAG水平降低至對照水平的35%，在反義寡核苷酸(ODN)處理組中，培養(yǎng)的軟骨細胞在低氧條件下產生的GAG量高于在常氧條件下。此外，他還發(fā)現(xiàn)HIF-1α缺乏的軟骨細胞顯示出游離三磷腺苷和糖酵解活性均降低，最后得出HIF-1α活性對于缺氧條件下骨性關節(jié)炎軟骨細胞的糖酵解、能量生成、軟骨基質蛋白合成以及細胞存活的調節(jié)至關重要。

HIF-1α是缺氧軟骨細胞重要的轉錄調節(jié)因子[30]，有促進軟骨細胞分化、存活及增殖的作用。程靜波和馮明利[31]研究表明，低氧狀態(tài)誘導HIF-1α表達，進而促進軟骨細胞的自噬。另有研究發(fā)現(xiàn)缺氧維持軟骨細胞表型，這與HIF-1α激活Yes相關蛋白(YAP)有關，HIF-1α/YAP信號軸可能在控制生長板軟骨細胞分化和維持生長板軟骨細胞中軟骨形成表型中起重要作用[26]。在生長板中，HIF-1α可以激活血管內皮生長因子非依賴性細胞自主機制，通過降低耗氧量維持缺氧軟骨中的氧水平[32]。而HIF-2α在滑膜炎和軟骨破壞過程中過表達，并且它通過調節(jié)各種分解代謝因子(例如MMP)和炎性介質的表達水平，在骨性關節(jié)炎中起著重要的分解代謝調節(jié)劑的作用。HIF-2α通過激活β-連環(huán)蛋白和核因子κB(NF-κB)信號通路介導軟骨破壞和軟骨細胞的死亡，可以加速骨性關節(jié)炎的進程[33]。為了控制軟骨的降解，HIF-2α可以直接增強啟動子活性，或通過與HIF-1α協(xié)同合作間接上調基質降解酶(如MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-12和MMP-13)的表達，HIF-2α還調節(jié)其他各種分解代謝因子的表達，例如X型膠原、VEGF、一氧化氮合酶(NOS)-2和前列腺素-過氧化物合酶2(PTGS2)，從而導致軟骨破壞[34]。因此，HIF-1α在缺氧條件下對軟骨形成、軟骨基質蛋白合成及軟骨細胞存活等方面發(fā)揮了重要作用，而HIF-2α在軟骨破壞及軟骨細胞死亡方面起著重要作用。

2.3缺氧與血管生成 VEGF是一種能有效促進血管再生的生長因子，VEGF通路被廣泛認為在細胞生命活動(增殖、遷徙、成熟和存活)中具有重要作用[35-36]。Saetan等[37]從KOA 80例血漿和滑膜樣本中發(fā)現(xiàn)了VEGF的過度表達，其表達水平與KOA的嚴重程度呈正相關，并可用于監(jiān)測KOA的嚴重程度。

缺氧環(huán)境可誘導促紅細胞生成素(EPO)，EPO首先誘導HIF-1的表達，HIF-1α促進了VEGF的表達，EPO和VEGF促進血管生成以適應缺氧環(huán)境并恢復氧含量[38]。此外，通過抑制蛋白酶體信號通路，HIF-1α沒有被降解而獲得穩(wěn)定，得以進入細胞核內與 VEGF 基因啟動子上的HRE結合，最后啟動 VEGF的轉錄和表達[39]。在一項針對骨性關節(jié)炎VEGF和 HIF的機制研究中發(fā)現(xiàn)，結締組織生長因子(CTGF)激活PI3K、AKT、ERK和NF-κB/ELK1通路上調miR-210表達并有助于抑制GPD1L表達和PHD2活性，并促進人骨性關節(jié)炎滑膜成纖維細胞中HIF-1α依賴性VEGF表達和血管生成[40]。Li等[41]發(fā)現(xiàn)成骨細胞中異常的甲狀腺激素受體(THRα)信號傳導是軟骨下骨血管生成的潛在機制。在另一項研究中，通過評估HIF-2α和VEGF與原發(fā)性KOA X線檢查嚴重程度關系，發(fā)現(xiàn)在骨性關節(jié)炎軟骨中，HIF-2α與VEGF mRNA和蛋白水平呈顯著正相關[42]。除此之外，Pufe等[43]發(fā)現(xiàn)在機械應力下骨性關節(jié)炎軟骨細胞通過HIF-1α途徑以自分泌或旁分泌方式增加 VEGF的表達。以上表明骨性關節(jié)炎軟骨在缺氧和機械壓力等多重因素的影響下，HIF-1α和HIF-2α對骨性關節(jié)炎中VEGF 的高表達具有重要意義。在滑膜炎癥中，HIF-1α和HIF-2α調控許多炎性和生長因子的表達，如CXCL-8和CXCL-20、NOS、VEGF、基質細胞衍生因子(SDF)-1[44]。近些年來，HIF和VEGF之間的研究越來越深入，特別是在分子基因水平和信號機制方面，并與其他有關因素聯(lián)系起來，說明對于這些問題的探究正在受到重視，但是仍然需要更多進一步的研究，這一切有望為建立一種新的特異性治療方式開辟途徑。

3 潛在治療作用

目前臨床已知的是缺氧和 HIF參與了KOA中軟骨的破壞、滑膜的炎癥和血管的生成等一系列病理生理過程，提示HIF可能是KOA潛在和重要的治療靶點。腫瘤在缺氧方面的研究較多且較為深入，包括應用缺氧激活前藥(HAP)、針對HIF特異性抑制劑或某些基因治療，其中幾種已進入臨床試驗[45]。這些治療方法大多以低氧為靶向通過運輸治療性物質到某些特定的部位，但是由于缺氧不僅是一個雙向雙面的病理狀態(tài)，也是正常生理狀況下的一個動態(tài)化過程，所以這種治療方式可能會帶來某些意想不到的不良反應和傷害。在一項臨床隨機Ⅱ期研究中發(fā)現(xiàn)，TH-302作為一種缺氧激活前藥最常見的不良反應包括疲勞、惡心、水腫、皮膚和黏膜毒性，以及骨髓抑制[46]。雖然在腫瘤和其他有關疾病中，這些藥物的臨床應用取得了初步的效果，但是HIF通路在KOA的機制和功能仍未完全闡明，以及服用這些藥物帶來的不良反應和藥代動力學問題，使得骨性關節(jié)炎中這些抑制劑真正應用于臨床仍有一段距離，仍需要繼續(xù)進行相關臨床試驗以評估其安全和有效性[47]。

綜上所述，KOA與HIF-1α和HIF-2α密切相關，HIF參與了KOA中軟骨的破壞、滑膜的炎癥及血管的生成等一系列病理生理過程。HIF-1α在缺氧的關節(jié)軟骨中起重要作用，對維持關節(jié)軟骨基質有保護作用，HIF-2α對關節(jié)軟骨(軟骨破壞及軟骨細胞死亡)有不良影響，HIF-3α可能是HIF-1α和HIF-2α的靶基因，起負調控的作用。但與此同時，仍然存在許多問題亟須解決，需要進一步研究HIF-1在骨性關節(jié)炎發(fā)病機制中的具體作用，研究其功能及表達差異，還需與 HIF-2α等因子聯(lián)合研究，并研究其與其他信號通路的交互作用。研究方面除了細胞層面的觀察，還需要多在動物體內進行研究，畢竟機體對低氧的調節(jié)是一個動態(tài)變化的過程，這為干預疾病的進展打下基礎，為延緩關節(jié)軟骨的退變提供可能。另外，現(xiàn)關于缺氧在滑膜和軟骨下骨方面的研究較少，滑膜病變與纖維化似乎密切相關，未來仍需要對缺氧在KOA發(fā)病機制中的作用進行更深入的研究，以期使HIF成為KOA治療的新靶點，在早期預測和關節(jié)破壞監(jiān)測方面發(fā)揮更多作用。