張釵紅，全昱沖，關(guān)德鳳，楊永秀

隨著腫瘤驅(qū)動(dòng)基因[1-2]和癌癥生物學(xué)的深入研究，多組學(xué)整合工具[1-2]和智能數(shù)字系統(tǒng)[3]等精準(zhǔn)醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，靶向藥物臨床試驗(yàn)[4]和耐受研究[5]的廣泛開展，腫瘤研究已進(jìn)入驅(qū)動(dòng)基因精準(zhǔn)診斷和靶向干預(yù)新時(shí)代。人類母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase， MELK)是蔗糖非發(fā)酵-1/磷酸腺苷依賴蛋白激酶相關(guān)激酶家族成員之一，是鼠人類絲/蘇氨酸蛋白激酶38(murine serine-threonine protein kinase 38， MPK38)和非洲爪蟾蛋白激酶Eg3的直系同源物。MELK作為一種重要的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，以激酶依賴的方式參與調(diào)控細(xì)胞周期[6]、增殖[7]、分化[7]、有絲分裂[8-9]、凋亡[6]、細(xì)胞骨架[10]、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[11]、癌細(xì)胞干性[12]、DNA損傷修復(fù)[13]和翻譯后修飾[6]等多種生物過程，在婦科主要惡性腫瘤的形成和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本文就MELK的結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)制及其與婦科主要惡性腫瘤的關(guān)系進(jìn)行綜述如下。

1 MELK概述

1.1MELK發(fā)現(xiàn)、定位和結(jié)構(gòu) 1997年Heyer等[11]使用差異顯示技術(shù)鑒定小鼠胚胎植入前階段優(yōu)先轉(zhuǎn)錄基因時(shí)發(fā)現(xiàn)一種新的母本轉(zhuǎn)錄基因——MELK。檢索NCBI基因數(shù)據(jù)庫，人類MELK定位于染色體9p13.2。

MELK的結(jié)構(gòu)：Ser/Thr激酶催化域包括N端半段結(jié)構(gòu)(非經(jīng)典泛素化結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn))[14]、C端半段結(jié)構(gòu)(與底物結(jié)合有關(guān)，參與激酶活化和活性調(diào)節(jié))[14]、鉸鏈區(qū)[15]和三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點(diǎn)[14-15]。非經(jīng)典泛素化結(jié)構(gòu)域包括調(diào)節(jié)激酶活性和維持激酶域的正確構(gòu)象[14]。C端調(diào)節(jié)區(qū)域包括TP二肽富集區(qū)(含多個(gè)磷酸化位點(diǎn))和激酶相關(guān)區(qū)域1[14-16]。

1.2MELK激活和作用機(jī)制 未磷酸化MELK的C端半段結(jié)構(gòu)T-環(huán)中存在分子內(nèi)二硫鍵，不吸收外源底物，還原劑等可破壞二硫鍵，實(shí)現(xiàn)Thr167的自身磷酸化活化MELK[14,16]。MELK活性的影響因素：MELK自身磷酸化、外源底物磷酸化、還原或氧化狀態(tài)、分子內(nèi)二硫鍵及鈣離子劑量等[14]。MELK激活后可通過直接結(jié)合和底物磷酸化與蛋白質(zhì)靶標(biāo)發(fā)生相互作用調(diào)控線粒體、凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[17]、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關(guān)蛋白(STRAP)/轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)[18]、JNK-cJUN、雌激素受體[19]、FAK/Paxillin[10]等信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能[14]。Gong等[18]在結(jié)直腸癌組織中發(fā)現(xiàn)，MELK可特異性結(jié)合STRAP,具有較強(qiáng)的致癌潛力。Liu等[7]在髓母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，MELK結(jié)合并誘導(dǎo)Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)磷酸化調(diào)節(jié)癌干樣細(xì)胞增殖。

2 MELK與腫瘤

2.1MELK與腫瘤促進(jìn) MELK作為一種重要的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，參與維持腫瘤起始細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[20]，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤[21]、橋腦膠質(zhì)瘤[22]、腎上腺皮質(zhì)癌[23]、乳腺癌[19]、胃癌[10]和結(jié)直腸癌[18]等大多數(shù)癌癥中均呈顯著高表達(dá)，MELK高表達(dá)與更強(qiáng)的瘤體形成能力顯著相關(guān)[12]。MELK為腫瘤細(xì)胞提供生長優(yōu)勢[24],促進(jìn)其生物學(xué)進(jìn)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，MELK高表達(dá)與腫瘤分期[18,21,25]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[18]、治療后復(fù)發(fā)[26]及患者預(yù)后不良[7,21,25]顯著相關(guān)。

2.1.1MELK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖：MELK主要通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期和凋亡促進(jìn)增殖。Wang等[17]在人視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，MELK聯(lián)合FoxM1的過表達(dá)可顯著降低經(jīng)科羅索酸處理后顯著上調(diào)的Y-79細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞數(shù)量和凋亡細(xì)胞百分比，有效逆轉(zhuǎn)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖。Li等[19]在三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞中通過沉默MELK導(dǎo)致G2停滯，Cyclin B和Cyclin D1表達(dá)顯著下調(diào)，抑制增殖。

2.1.2MELK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移：MELK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移、腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。MELK敲低可抑制FAK和Paxillin的磷酸化,顯著減少遷移和侵襲的胃癌細(xì)胞數(shù)量[10]。MELK過表達(dá)可顯著增加胃癌移植瘤裸鼠腹膜內(nèi)結(jié)節(jié)數(shù)量，促進(jìn)腹膜擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[10]。Gong等[18]在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，MELK高表達(dá)組較低表達(dá)組更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.2MELK與腫瘤治療

2.2.1MELK抑制劑：MELK抑制劑可靶向干預(yù)高度增殖的腫瘤細(xì)胞及其來源的腫瘤干細(xì)胞用于腫瘤治療[24]。高通量篩選：Chung等[20]使用IMAP法篩選AMRI化合物庫發(fā)現(xiàn)最有效的MELK抑制劑OTSSP 167，可有效抑制MELK活性及其底物類腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(DBNL)和蛋白酶體亞基α1的磷酸化，降低癌細(xì)胞的侵襲性和干性[20]。Ren等[12]在頭頸部鱗癌(HNSCC)中發(fā)現(xiàn)，OTSSP 167可下調(diào)HNSCC細(xì)胞的SOX2表達(dá)靶向癌癥干細(xì)胞，影響癌細(xì)胞干性和致瘤性。基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選：Zhou等[27]從Vitas-M化學(xué)數(shù)據(jù)庫中篩選出對MELK抑制作用最強(qiáng)的化合物16可有效阻止FAK磷酸化，抑制SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲。脫靶/交叉篩選：Edupuganti等[28]從已知激酶抑制劑文庫中篩選出最有效的MELK抑制藥物Nintedanib，在其5位上添加甲酯提高對MELK效能和選擇性，形成一種最有效的針對MELK催化域的吲哚酮抑制劑——IN17[29]，可抑制HCC70細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)，優(yōu)先抑制MELK高表達(dá)TNBC細(xì)胞增殖。中醫(yī)中藥：血根堿在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中下調(diào)和解離STRAP和MELK，激活Bax誘導(dǎo)凋亡，抑制增殖[18]。

2.2.2MELK與腫瘤治療耐受：MELK在mRNA和蛋白質(zhì)水平的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的抗輻射性和化學(xué)耐藥性顯著相關(guān)[10,26]。MELK的抑制可削弱腫瘤生長，提高放射治療和化學(xué)治療敏感性。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，OTSSP 167抑制MELK及其靶基因EZH2的表達(dá)，抑制放射治療和化學(xué)治療誘導(dǎo)的折疊復(fù)制叉的形成，提高細(xì)胞對喜樹堿或放射線的敏感性[21]。在乳腺癌中，MELK敲低或OTSSP 167顯著延遲放射治療后dsDNA斷裂的修復(fù)，增強(qiáng)放射敏感性[26]。在胃癌中，MELK敲低誘導(dǎo)氟尿嘧啶處理后的NCI-N87細(xì)胞凋亡，增加氟尿嘧啶敏感性[10]。

3 MELK在婦科腫瘤中研究進(jìn)展

3.1MELK與宮頸癌 MELK促進(jìn)宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展，經(jīng)免疫組織化學(xué)(IHC)測定顯示，從正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)到宮頸癌，MELK的表達(dá)率逐漸升高[13]。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測發(fā)現(xiàn)，宮頸癌或?qū)m頸癌和CINⅢ組織中的MELK mRNA表達(dá)顯著高于正常組織[13，24，30]。經(jīng)qPCR和蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測表明，宮頸癌SiHa、HeLa、C33A和CasKi細(xì)胞系中的MELK mRNA和蛋白表達(dá)水平均被上調(diào)[13]。

MELK促進(jìn)宮頸癌增殖生長和早期轉(zhuǎn)移。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8和集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MELK敲低抑制C33A和CasKi細(xì)胞增殖及C33A和HeLa細(xì)胞集落形成能力[13]。通過WB檢測顯示，MELK敲低顯著上調(diào)C33A細(xì)胞P53和Caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡[13]。通過IHC測定表明，MELK的高表達(dá)與宮頸癌的早期轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，有淋巴或血管轉(zhuǎn)移的Ⅱa期宮頸癌患者M(jìn)ELK的高表達(dá)率顯著高于無轉(zhuǎn)移者[13]。

MELK通過分子靶向干預(yù)、免疫療法和聯(lián)合療法參與宮頸癌治療，目前正處于臨床前研究和Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段[13，31-32]。分子靶向干預(yù)：OTSSP 167可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖生長，加劇DNA損傷，誘發(fā)凋亡。經(jīng)OTSSP 167處理后，通過集落形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C33A和HeLa細(xì)胞集落形成和致癌性生長能力降低，通過CCK-8和WB檢測發(fā)現(xiàn)C33A、SiHa和HeLa細(xì)胞的增殖抑制率，C33A細(xì)胞中DNA破壞點(diǎn)標(biāo)記蛋白γ-H2AX和裂解Caspase-3的表達(dá)隨著OTSSP 167濃度的升高而升高[13]。癌癥免疫肽疫苗療法[31]：鉑類耐藥的人類白細(xì)胞抗原(HLA-A)單倍型2402的宮頸癌患者接種含MELK、FOXM1、HJURP、VEGFR-1、VEGFR-2的5肽疫苗的Ⅰ期劑量遞增試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，患者進(jìn)行疫苗接種是安全的，該疫苗可與MHC-1結(jié)合，在78%和89%的患者中觀察到強(qiáng)烈的抗MELK和FOXM1的特異性細(xì)胞毒性CD8+ T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。MELK和FOXM1是高度免疫原性抗原，是宮頸癌患者免疫治療的有希望的靶標(biāo)。聯(lián)合療法：Budczies等[32]在宮頸癌組織癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集中檢測到涉及程序性死亡受體-配體1(PD-L1)的9p染色體上的復(fù)發(fā)拷貝數(shù)增加和MELK mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，并與免疫過程顯著相關(guān)，故有必要進(jìn)一步研究MELK免疫療法聯(lián)合PD-L1阻斷劑治療宮頸癌的效果。

MELK可能通過調(diào)節(jié)化學(xué)治療藥物敏感性參與宮頸癌治療耐受過程。MELK敲低可通過同源重組途徑加劇C33A細(xì)胞DNA損傷，誘導(dǎo)凋亡，提高順鉑敏感性。經(jīng)MELK敲低聯(lián)合順鉑1 μg/ml處理C33A細(xì)胞后，與單獨(dú)使用順鉑相比，γ-H2AX和Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，DNA損傷同源重組修復(fù)蛋白Mre11和Rad 50的表達(dá)顯著下調(diào)[13]。

MELK主要影響宮頸癌患者治療后的疾病狀態(tài)和生存時(shí)間。根據(jù)RECISTv1.1標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測患者接種包含MELK的5肽疫苗后的臨床反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，66.7%患者在3.0～10.3個(gè)月達(dá)到了疾病穩(wěn)定狀態(tài)，89.0%患者的中位無進(jìn)展生存期為3.3個(gè)月[31]。

3.2MELK與卵巢癌 MELK促進(jìn)卵巢癌發(fā)生和進(jìn)展，GEO數(shù)據(jù)庫9個(gè)數(shù)據(jù)集分析顯示，MELK表達(dá)從漿液性良性腫瘤、交界性腫瘤到卵巢癌逐漸上調(diào)，漿液性良性腫瘤中MELK表達(dá)顯著高于正常組織[33]。TCGA數(shù)據(jù)集分析顯示，MELK表達(dá)隨著卵巢癌組織學(xué)分級的升高和病理分化程度的降低而上調(diào)[33]。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，卵巢腫瘤組織中MELK mRNA表達(dá)顯著高于正常樣品[24]。WB檢測發(fā)現(xiàn)，MELK表達(dá)在上皮性卵巢癌SKOV3、OVCAR8、IGROV1、OVCAR4細(xì)胞系中最高，在正常卵巢細(xì)胞中幾乎檢測不到[33]。

MELK促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞致癌性生長和增殖。MELK敲低抑制卵巢癌OVCAR8細(xì)胞系集落形成和致癌性生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制增殖。經(jīng)集落形成實(shí)驗(yàn)表明，MELK敲低抑制軟瓊脂中的OVCAR8細(xì)胞系集落形成和致癌性生長。經(jīng)WB檢測顯示，在MELK敲低的OVCAR8細(xì)胞中存在明顯的多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 (PARP)-1裂解，誘導(dǎo)凋亡，抑制增殖[33]。

MELK通過小分子抑制劑靶向干預(yù)和聯(lián)合治療參與卵巢癌治療。小分子抑制劑：①OTSSP 167：OTSSP 167誘導(dǎo)G2/M期停滯抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、集落形成和錨定依賴性和非依賴性生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，OTSSP 167處理后BG1和OVCAR8細(xì)胞的細(xì)胞核更大，可誘導(dǎo)明顯的G2/M過渡期轉(zhuǎn)換停滯，抑制增殖。通過3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)分析顯示，OTSSP 167抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的效率是正常細(xì)胞的3倍。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，OTSSP 167抑制軟瓊脂上SKOV3、OVCAR8、OVCAR5細(xì)胞的錨定非依賴性生長和SKOV3、OVCAR8、OVCAR5、OVCAR4細(xì)胞的錨定依賴性生長。WB檢測顯示，經(jīng)OTSSP 167處理的卵巢癌細(xì)胞系存在明顯的PARP-1裂解，誘導(dǎo)凋亡[33]。②Nintedanib：Edupuganti等[28]進(jìn)行脫靶/交叉篩選出最有效的MELK抑制藥物Nintedanib。Nintedanib在卵巢癌中的應(yīng)用目前正處于臨床試驗(yàn)階段，且多聯(lián)合其他療法使用[34-35]。Nintedanib在卵巢癌早期臨床試驗(yàn)中具有較好的活性和安全性，在術(shù)后進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)低的卵巢癌患者中的療效顯著，無進(jìn)展生存期延長了7個(gè)月[35]。聯(lián)合治療：①OTSSP 167聯(lián)合化學(xué)治療藥物：MTT分析表明，在OVCAR8細(xì)胞中，OTSSP 167聯(lián)合卡鉑比單用卡鉑具有更高的療效和細(xì)胞毒性[33]。②免疫療法聯(lián)合PD-L1阻斷劑：在卵巢癌組織TCGA數(shù)據(jù)集[32]中檢測到涉及PD-L1的9p染色體上的復(fù)發(fā)拷貝數(shù)增加和MELK mRNA表達(dá)的顯著上調(diào)，并與免疫系統(tǒng)的熱微環(huán)境吸引效應(yīng)細(xì)胞顯著相關(guān)，一旦PD-L1檢查點(diǎn)封鎖到位，該效應(yīng)細(xì)胞就可以消除腫瘤細(xì)胞，故有必要進(jìn)一步研究MELK免疫療法聯(lián)合PD-L1阻斷劑在卵巢癌中的療效。MELK抑制劑OTSSP 167可增強(qiáng)化學(xué)治療敏感性逆轉(zhuǎn)卵巢癌化學(xué)治療耐藥。OTSSP 167增強(qiáng)OVCAR 8細(xì)胞對卡鉑的敏感性，MTT分析表明，OTSSP 167聯(lián)合卡鉑比單用卡鉑更有效[33]。OTSSP 167在耐順鉑和紫杉醇的卵巢癌細(xì)胞中保留了其細(xì)胞毒性和有效性，MTT分析表明，耐順鉑的TYK-nu(R)細(xì)胞和耐紫杉醇的IGROV1-PXL細(xì)胞對OTSSP 167的敏感性顯著高于其親代細(xì)胞。OTSSP 167在抗藥性卵巢癌細(xì)胞系中仍然有效且不產(chǎn)生卡鉑、紫杉醇或阿霉素的交叉耐藥，是抗藥性卵巢癌治療的重要制劑[33]。

MELK主要影響卵巢癌患者治療后的生存時(shí)間。TCGA數(shù)據(jù)庫卵巢癌患者生存分析表明，上皮性卵巢癌中MELK高表達(dá)與較短的無進(jìn)展生存期顯著相關(guān)，提示預(yù)后不良[33]。

綜上所述，MELK可直接結(jié)合和底物磷酸化靶蛋白參與調(diào)控多種生物過程，促進(jìn)婦科惡性腫瘤的形成和進(jìn)展，參與其綜合治療、治療后耐受和預(yù)后評估等過程，是一種重要的癌癥驅(qū)動(dòng)基因，有望成為宮頸癌和卵巢癌分子治療的靶標(biāo)和預(yù)后監(jiān)測的標(biāo)志物。然而，MELK的功能及其在婦科惡性腫瘤中的分子機(jī)制仍未完全闡明，MELK靶標(biāo)抑制劑目前正處于臨床前和臨床試驗(yàn)階段，仍未得到美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用，且存在脫靶、特異性爭議[9]和缺乏大樣本臨床數(shù)據(jù)支持等問題。因此，應(yīng)進(jìn)一步深化MELK及其抑制劑在婦科惡性腫瘤中的功能、作用機(jī)制和調(diào)控途徑的認(rèn)識，進(jìn)一步優(yōu)化升級和合理使用現(xiàn)有精準(zhǔn)醫(yī)療技術(shù)工具，進(jìn)一步探討如何構(gòu)建和使用最有效的特異性最高的MELK靶向制劑，從而為婦科惡性腫瘤的臨床監(jiān)測、精準(zhǔn)診治和預(yù)后判定提供重要思路。