孟佳佳 郭文博 張志岐 王松雪 聶冬霞 葉 金郭大凱 王 敏 趙志輝 徐劍宏 韓 錚*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海市奉賢區(qū) 201403；2國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京市西城區(qū) 100037；3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京市海淀區(qū) 100081；4江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇省南京市 210014）

伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、輪狀鐮刀菌（Fusarium verticilllioides）等在一定溫濕度條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)幾十種伏馬毒素，其中最重要的是伏馬毒素B1（Fumonisin B1，以下簡(jiǎn)稱為FB1）和伏馬毒素B2（Fumonisin B2，以下簡(jiǎn)稱為FB2）[1]，其具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、器官和組織毒性、生殖毒性、致癌性等，且國際癌癥研究中心把伏馬毒素列為2B級(jí)致癌物[2-3]。

目前，伏馬毒素的主要檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、衍生化后液相色譜熒光檢測(cè)等，但不同實(shí)驗(yàn)室甚至同一實(shí)驗(yàn)室采用不同的檢測(cè)方法，對(duì)同一樣品的分析結(jié)果之間存在明顯差異，量值很難統(tǒng)一，難以確保不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的可比性[4]。同時(shí)，基體參考物質(zhì)是具有高度均勻性、良好穩(wěn)定性和量值準(zhǔn)確性的一種計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，有利于克服由于基體效應(yīng)所引起的誤差，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和量值的可溯源性，且其可用于校準(zhǔn)儀器、驗(yàn)證檢測(cè)方法及實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制等[5]。此外，由于FB1和FB2的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與被FB1和FB2污染的小麥和玉米樣品之間存在較大的差異，其進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)的生理活性、生物轉(zhuǎn)化路徑及毒性強(qiáng)弱均不一致，從而導(dǎo)致其代謝、毒理研究結(jié)果的不可靠，而基體參考物質(zhì)在性質(zhì)上、基體組成上與實(shí)際樣品一致。因此，采用基體參考物質(zhì)替代純真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行此方面的研究更具有應(yīng)用價(jià)值及指導(dǎo)意義。但是，目前國內(nèi)尚未有FB1和FB2基體參考物質(zhì)及其制備方法的報(bào)道。在此背景下，本研究擬以相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)以及ISO導(dǎo)則[6-10]為指導(dǎo)，研制玉米粉中FB1和FB2的基體參考物質(zhì)，以期能對(duì)玉米粉中伏馬毒素的檢測(cè)、毒理代謝等研究起到促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Waters超高效液相色譜儀、串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀Warters TQS（美國Warters公司），Heraeus Multifuge X3高速離心機(jī)、Thermo Scientific Heraguard ECO 超凈臺(tái)（美國Thermo Fisher scientific公司），霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），SX-500高壓滅菌鍋（日本TOMY公司），水浴氮吹儀（青島路博環(huán)保儀器公司），DWH三維混合機(jī)（上海德越粉體機(jī)械有限公司）。

PDA粉末（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），甲醇、乙腈（美國Merck公司，色譜純），醋酸銨（美國Aladdin公司，色譜純），F(xiàn)B1標(biāo)準(zhǔn)品（50μg/mL）和FB2標(biāo)準(zhǔn)品（50 μg/mL）（Sigma-Aldrich公司，St. Louis，MO，USA)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：稱取40.0 g PDA粉末于1 L蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌20 min備用。

玉米培養(yǎng)基：稱取50 g玉米粉至 250 mL三角瓶，加入20 mL蒸餾水混勻，用透氣封口膜密封瓶口，浸泡過夜，高壓滅菌（121 ℃，20 min），冷卻后將玉米粉搖散待用。

玉米粉（經(jīng)檢測(cè)不含F(xiàn)B1和FB2）購于上海大型超市，串珠鐮刀菌由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所提供。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00±0.01 g待檢樣品，置于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈-水溶液（50/50，v/v）作為提取劑，渦旋混合30 s，浸泡5 min，超聲提取1 h，4 000 r/min離心10 min。取上清液過0.22 μm濾膜，用甲醇-水溶液（20/80，v/v）稀釋10 000倍后，采用超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (UPLC-MS/MS）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120EC-C18（100 mm × 3.0 mm，2.7 μm）（Agilent，CA，USA）。

流動(dòng)相：A相為甲醇溶液；B相為5 mmol/L醋酸銨水溶液。

梯度洗脫：0～0.5 min，10%A；6 min，90%A；6.5 min，90%A；6.7 min，10%A；8 min，10%A；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量3 μL；柱溫40 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子掃描模式（ESI+），脫溶劑氣、錐孔氣均為高純氮?dú)?，碰撞氣為高純氬氣，脫溶劑溫度?00 ℃，離子源溫度為150 ℃，錐孔氣流和脫溶劑氣流分別是7.0 L/h和1 000 L/h，通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)目標(biāo)化合物準(zhǔn)確定量，F(xiàn)B1和FB2的母離子、子離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 FB1和FB2的質(zhì)譜條件參數(shù)

1.3 參考物質(zhì)的制備

1.3.1 菌株的活化

將串珠鐮刀菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，備用。

1.3.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

用無菌打孔器在菌落上取直徑為0.5 cm的菌絲塊，將菌絲塊接種至玉米培養(yǎng)基中，用無菌透氣封口膜密封，置于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4周。接種第1周，每天振蕩三角瓶1次，使菌絲與培養(yǎng)基充分接觸。

1.3.3 基體參考物質(zhì)制備

培養(yǎng)結(jié)束后，將錐形瓶中的產(chǎn)毒培養(yǎng)基取出置于烘箱50 ℃烘干，打碎成粉末過60目篩后，將含有高濃度FB1和FB2的玉米培養(yǎng)基粉末封存在自封袋中待用。稱取上述制備得到的含有高濃度FB1和FB2的玉米培養(yǎng)基粉末，與空白玉米粉（經(jīng)檢測(cè)無FB1和FB2）均勻混合，逐級(jí)稀釋，制備獲得玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)。選用鋁箔袋，將制備好的玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)抽真空分裝，每個(gè)包裝50 g，密封100個(gè)包裝，置于-20 ℃保存。

1.4 均勻性檢驗(yàn)

按照J(rèn)JG 1006-1994[6]和JJF 1343-2012[7]的相關(guān)規(guī)定，從制備獲得的FB1和FB2基體參考物質(zhì)中隨機(jī)取樣15個(gè)包裝單元，每個(gè)包裝單元中取樣2.00 g（最小取樣量為2.00 g），重復(fù)取樣3次，采用UPLC-MS/MS法平行測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果采用方差分析法（經(jīng)F檢驗(yàn)），統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)參考物質(zhì)的均勻性。

1.5 穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)

根據(jù)JJG 1006-1994和JJF 1343-2012的要求，將樣品置于4 ℃恒溫箱中保存，模擬運(yùn)輸條件以考察參考物質(zhì)的短期穩(wěn)定性。分別在第0、2、4、6、8天進(jìn)行短期穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)，每次抽取3個(gè)包裝單元，每個(gè)包裝平行測(cè)3次。

參考物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察按照先密后疏的原則，在第0、1、3、6、12個(gè)月進(jìn)行-20 ℃儲(chǔ)存條件下長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。

1.6 參考物質(zhì)的定值和不確定度評(píng)估

參考物質(zhì)的定值采用多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值、數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計(jì)的方式。參加聯(lián)合定值的6家實(shí)驗(yàn)室均具有相應(yīng)的檢測(cè)資質(zhì)，并具有FB1和FB2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的條件，各家實(shí)驗(yàn)室在分析過程中進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，采用UPLC-MS/MS法對(duì)制備的參考物質(zhì)進(jìn)行定值。對(duì)6家實(shí)驗(yàn)室提供的數(shù)據(jù)，用狄克遜（Dixon）法檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)是否有離群值，隨后采用科克倫（Cochran）法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度為等精度后，最后計(jì)算出總平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)的不確定度主要由參考物質(zhì)的不均勻引入的不確定度（ubb）、參考物質(zhì)的不穩(wěn)定引入的不確定度（usts）、參考物質(zhì)定值引入的不確定度（uA）三部分組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻性檢驗(yàn)

采用單因素方差分析法進(jìn)行組內(nèi)和組間均勻性檢驗(yàn)。由表2可知，F(xiàn)＜F0.05（14,30），表明玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)均勻性良好，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求。

表2 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)的均勻性

2.2 穩(wěn)定性檢測(cè)

2.2.1 短期穩(wěn)定性考察

由表3可知，經(jīng)直線擬合法對(duì)短期穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，可見｜b1｜

2.2.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察

由表4可知，經(jīng)直線擬合法對(duì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，可見｜b1｜

2.3 定 值

6家實(shí)驗(yàn)室的玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)定值結(jié)果見表5。將所有實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)匯總分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的組內(nèi)數(shù)據(jù)經(jīng)狄克遜準(zhǔn)則檢驗(yàn)是否有異常值，各實(shí)驗(yàn)室的定值數(shù)據(jù)采用科克倫準(zhǔn)則判斷數(shù)據(jù)是否等精度，最終6家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)均被采用。因此，本參考物質(zhì)的定值結(jié)果為6家實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的總平均值，即FB1的含量為1.07 mg/kg，F(xiàn)B2的含量為0.43 mg/kg。

表3 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)的短期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

表4 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.4 不確定度評(píng)估

2.4.1 均勻性引入的不確定度

FB1均勻性引入的不確定度：

FB2均勻性引入的不確定度：ubb=0.008 2 mg/kg。

2.4.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

FB1短期穩(wěn)定性引入的不確定度：usts=s(b1)·t=0.003 9×8=0.031 2 mg/kg。

FB1長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度：ults=0.0271mg/kg。

FB2短期穩(wěn)定性引入的不確定度：usts=0.0230mg/kg。

FB2長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度：ults=0.0235mg/kg。

表5 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)定值結(jié)果 （單位：mg/kg）

2.4.3 定值引入的不確定度

本參考物質(zhì)的定值采用6家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方法，經(jīng)狄克遜和科克倫檢驗(yàn)，6家實(shí)驗(yàn)室的平均值為合作定值結(jié)果，將這6組實(shí)驗(yàn)室的平均值作為一組新的數(shù)據(jù)，計(jì)算定值引入的不確定度。

FB1定值引入的不確定度：

FB2定值引入的不確定度：

2.4.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

FB1的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

FB2的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.4.5 擴(kuò)展不確定度

FB1的擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度：U=k·uCRM=2×0.043 0≈0.09 mg/kg (k=2)。

FB2的擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度：U=k·uCRM=2×0.034 3≈0.07 mg/kg (k=2)。

2.5 定值結(jié)果

玉米粉中伏馬毒素B1和B2基體參考物質(zhì)中FB1的含量為1.07 ±0.09 mg/kg，F(xiàn)B2的含量為0.43±0.07 mg/kg。

3 結(jié) 論

本研究通過將產(chǎn)毒菌株接種于玉米培養(yǎng)基，在最佳條件下培養(yǎng)，從而得到含大量FB1和FB2的基質(zhì)樣本，將其打碎成粉末并過篩，與空白玉米粉等比例稀釋搖勻，獲得了玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)。組織6家實(shí)驗(yàn)室利用UPLC-MS/MS法進(jìn)行了聯(lián)合定值，考察了其均勻性和穩(wěn)定性，并對(duì)研制過程中產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。結(jié)果表明，該基體參考物質(zhì)均勻性良好，且滿足12個(gè)月以上的穩(wěn)定性要求，最終得到玉米粉中FB1和FB2基體參考物質(zhì)的量值分別為1.07±0.09 mg/kg和0.43±0.07 mg/kg。因此，該參考物質(zhì)可用于玉米粉中FB1和FB2的定性和定量檢測(cè)、FB1和FB2檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)及其代謝毒理學(xué)研究等。本研究為國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與監(jiān)測(cè)溯源體系的建立，提供了一定的技術(shù)支持與物質(zhì)保障。