李 芬，李愛民，，劉瀟瀟，吳曉磊，李子杰*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.國(guó)珍健康科技（北京）有限公司，北京102206）

0 引言

尿路感染（UIT）作為一種高發(fā)性疾病，給醫(yī)療系統(tǒng)帶來沉重負(fù)擔(dān)［1］。UIT可引發(fā)尿毒癥、腎膿腫和急性腎損傷等疾病，具有急性發(fā)病率和死亡率的風(fēng)險(xiǎn)。UIT通常由多種細(xì)菌引起，其中尿路致病性大腸桿菌（UropathogenicEscerichia Coli，UPEC）是 主 要病 原體。UPEC感染會(huì)引發(fā)UIT，隨后通過尿道感染膀胱，甚至通過輸尿管到達(dá)腎臟，進(jìn)而引發(fā)腎臟永久性的損傷［2］。治療尿路感染主要使用抗生素，如頭孢菌素［3］、氟喹諾酮類藥物［4］、氨基糖苷類藥物［5］和碳青霉烯類藥物［6］，雖然抗生素能夠在一定程度上治療尿路感染，但有副作用，包括產(chǎn)生耐藥性和減少有益的腸道微生物。因此，尋求其他非抗生素物質(zhì)替代或減少抗生素在UIT治療中的使用具有重要意義。

蔓越莓廣泛種植于北美地區(qū)，在美容養(yǎng)顏和UIT、胃腸道、口腔、腫瘤、血管等相關(guān)疾病的預(yù)防和治療上具有顯著效果［7］。蔓越莓發(fā)揮作用的主要機(jī)理是其富含的原花青素可以改變UIT主要病原體UPEC對(duì)人尿道上皮細(xì)胞（HUC）黏附能力，使其難以附著在尿路和膀胱的細(xì)胞上并隨尿液被排出體外，從而實(shí)現(xiàn)UIT的預(yù)防和治療［8］。UPEC的菌毛分為P，F(xiàn)，1型［9］，其中P菌毛類型的UPEC是感染尿道上皮細(xì)胞的主要菌種［10］。藍(lán)娜娜等［11］通過體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)蔓越莓提取物可以抑制UPEC對(duì)人尿道上皮細(xì)胞（HUC）的黏附；本研究在此基礎(chǔ)上，通過人體試吃實(shí)驗(yàn)，探究蔓越莓壓片糖果對(duì)UPEC黏附HUC的影響，為蔓越莓相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人尿道上皮細(xì)胞（HUC），上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；尿道致病性P型大腸桿菌（UPEC），美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC700336）；蔓越莓壓片糖果，新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）有限公司；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清和100×青鏈霉素混合液，Hyclone公司；Giemsa染色試劑盒和Hanks溶液，上海生工生物工程公司；4-二甲基氨基肉桂醛（HPLC純）和原花青素A2（HPLC純），Sigma公司；甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、乙酸（分析純）、鹽酸（分析純）以及丙酮（HPLC純），國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MOC-18AIC CO2培養(yǎng)箱，日本Panasonic公司；NU-425-400S二級(jí)生物安全柜，美國(guó)Nuaire公司，BA210酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-rad公司；CT15RE離心機(jī)，日本HITACHI公司；Ts2-FL顯微鏡，日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 人體試吃蔓越莓壓片糖果方案

為了測(cè)定試食蔓越莓壓片糖果人員尿液對(duì)UPEC黏附HUC的影響，隨機(jī)抽選61名人員進(jìn)行蔓越莓壓片糖果的試吃實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)人員一周內(nèi)嚴(yán)禁食用含有原花青素的食物。首先在未服用蔓越莓壓片糖果前，試吃人員收集中段尿液約25 mL作為服藥前尿液樣品（0 h）。隨后服用8片蔓越莓壓片糖果，并在服用后2 h，4 h，8 h，12 h收集中段尿液25 mL作為服用后不同時(shí)間的樣品，樣品在4℃保存。

1.3.2 原花青素含量測(cè)定

采用4-（二甲氨基）肉桂醛（DMAC）法［12］測(cè)定樣品中原花青素的含量。吸取700μL不同濃度原花青素A2標(biāo)準(zhǔn)品（0 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L，25 mg/L）或700μL尿液上清樣品，加入到2.1 mL 0.1%DMAC試劑中，充分混勻后計(jì)時(shí)。分別吸取200μL到96孔板，室溫放置一定時(shí)間后用酶標(biāo)儀在640 nm進(jìn)行吸光度值測(cè)定，在讀取第一次吸光度之前至少要等待20 min，每5 min讀取一次數(shù)值（從20 min開始直至35～40 min），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿液中原花青素的含量。

1.3.3 UPEC黏附HUC實(shí)驗(yàn)

將服用前尿液樣品和服用后2 h，4 h，8 h，12 h尿液樣品4 000 g，離心10 min，取上清液900μL和100μL UPEC 37℃共培養(yǎng)30 min。將HUC消化稀釋至105個(gè)/mL和經(jīng)過預(yù)處理的UPEC在37℃共培養(yǎng)1 h。孵育結(jié)束后，3 000 g離心3 min，沉淀物用Hanks溶液清洗兩次，清除未黏附的細(xì)菌后涂片，并用甲醇固定，使用Giemsa染液染色15 min，用無菌水沖洗未結(jié)合的染液，結(jié)合蓋玻片制片。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)HUC黏附UPEC的數(shù)目。其中服用前樣品（0 h）為對(duì)照組，服用后2 h，4 h，8 h，12 h為實(shí)驗(yàn)組。采用Origin 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中原花青素的含量

本研究檢測(cè)61名受試者服用蔓越莓壓片糖果后不同時(shí)間段（0 h，2 h，4 h，8 h，12 h）尿液中的原花青素含量。由于個(gè)體差異，每個(gè)受試者尿液中原花青素含量不同，服用前人體尿液中的原花青素質(zhì)量濃度較低，平均為7.78 mg/L；而服用蔓越莓壓片糖果2～8 h后的處理組中，人體尿液中原花青素含量逐漸上升，服用后8 h樣本組中原花青素含量最高，平均值約為18.0 mg/L；12 h樣本組中原花青素質(zhì)量濃度降低，約為9.45 mg/L。通過顯著性差異分析，結(jié)果如圖1所示：與服用蔓越莓壓片糖果前（0 h）比較，2 h，4 h，8 h后尿液中的原花青素含量都具有極顯著性差異，12 h后尿液中的原花青素含量不具有顯著性差異。

圖1 尿液中原花青素的濃度

2.2 人體試食蔓越莓壓片糖果對(duì)UPEC黏附HUC的影響

以1號(hào)和2號(hào)樣本組為例在顯微鏡觀察后進(jìn)行說明，服用前的HUC細(xì)胞可黏附較多的UPEC，而服用蔓越莓壓片糖果2～8 h后的處理組中，單個(gè)尿道上皮細(xì)胞黏附的大腸桿菌數(shù)量遞減，12 h樣本組中尿道細(xì)胞黏附大腸桿菌數(shù)量增加（見圖2）。總體上來說，服用蔓越莓壓片糖果前的HUC可黏附較多的UPEC，平均可黏附44個(gè)；而服用蔓越莓壓片糖果2～8 h后的處理組中，單個(gè)HUC黏附的UPEC數(shù)量明顯遞減，2 h后平均可黏附35個(gè)UPEC，4 h后平均可黏附28個(gè)UPEC，8 h后平均可黏附17個(gè)UPEC。然而服用蔓越莓壓片糖果12 h后UPEC的個(gè)數(shù)明顯增加，平均可黏附37個(gè)UPEC。通過顯著性差異分析，如圖3所示：與服用蔓越莓壓片糖果前（0 h）比較，2 h，4 h，8 h后HUC黏附的UPEC數(shù)量減少，具有極顯著性差異，12 h后HUC黏附的UPEC數(shù)量減少具有顯著性差異，但同8 h相比HUC黏附的UPEC數(shù)量明顯增加。

圖2 人體試食蔓越莓壓片糖果對(duì)UPEC黏附HUC的影響

圖3 HUC上所黏附的UPEC數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.3 原花青素對(duì)UPEC的抗黏附作用的濃度-時(shí)間效應(yīng)曲線

如上所述，蔓越莓壓片糖果中原花青素對(duì)UPEC黏附人尿道上皮細(xì)胞具有抑制作用。如圖4所示，與樣品中原花青素含量相對(duì)應(yīng)，不同階段樣品處理過的UPEC對(duì)人尿道上皮細(xì)胞的黏附作用不同。隨著服用蔓越莓壓片糖果時(shí)間的增加，尿液中原花青素的含量逐漸升高，HUC黏附UPEC個(gè)數(shù)逐漸減少，8 h后原花青素的濃度最高，此時(shí)HUC黏附UPEC的個(gè)數(shù)最低。12 h后，尿液中原花青素的含量降低，同時(shí)HUC黏附UPEC個(gè)數(shù)增加，說明原花青素對(duì)UPEC的抗黏附作用具有濃度依賴性。

圖4 原花青素對(duì)UPEC的抗黏附作用的濃度-時(shí)間效應(yīng)曲線

3 結(jié)語

尿路感染70%～90%是由尿路致病性大腸桿菌引起的，同時(shí)也是全世界最常見的感染類型之一，在世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。尋找預(yù)防和治療尿路感染的天然替代品引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注。蔓越莓有多種酚類物質(zhì)，其中原花青素能夠有效抑制P型菌毛大腸桿菌的黏附作用。本研究隨機(jī)選取61名志愿者，對(duì)志愿者服用蔓越莓壓片糖果尿液中的原花青素的含量進(jìn)行定量，并建立蔓越莓原花青素對(duì)尿道致病性細(xì)菌的抗黏附作用的濃度-時(shí)間效應(yīng)曲線。結(jié)果表明蔓越莓壓片糖果在體內(nèi)吸收代謝后經(jīng)腎排泄后仍有抗黏附效力，可用于預(yù)防和治療非復(fù)雜性尿路感染，從而為臨床上治療尿路感染提供科學(xué)依據(jù)。