賴小梅，李 根，陳 捷，黃豫萌，馬建芳

1 資料與方法

1.1 資料 研究人群：RLS/WED是由2位RLS/WED專家根據(jù)2014年國(guó)際RLS/WED研究組(IRLSSG)診斷標(biāo)準(zhǔn)的修訂版進(jìn)行診斷的[2]。我們?nèi)虢M了原發(fā)性RLS/WED，排除了繼發(fā)性RLS/WED，包括繼發(fā)于帕金森病、腎功能不全、缺鐵、糖尿病和周圍神經(jīng)病等。對(duì)照組樣本招募了社區(qū)健康人群，并由RLS/WED專家進(jìn)行了評(píng)估，以排除RLS/WED和原發(fā)性震顫。我們對(duì)每位入組的患者和健康人群都進(jìn)行了鐵蛋白的檢測(cè)，鐵蛋白水平降低的患者也被排除在外。IRLSSG評(píng)分量表用于評(píng)估RLS/WED的嚴(yán)重程度[16]。該研究得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。此外，所有RLS/WED的治療病史由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院提供。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法 DNA制備和基因分型：我們從每個(gè)參與者收集約2 ml血液樣品，采用苯酚-氯仿-異丙醇法提取DNA[17]。通過(guò)聚合物鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的基因片段包含：STK32B的rs10937625，CTNNA3的rs7903491，rs10822974和rs12764057以及PPARGC1A的rs17590046。擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)來(lái)自于國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Primer-BLAST網(wǎng)站(https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/primerblast/index. cgi LINK_LOC=BlastHome)。使用Sequenom MassARRAY系統(tǒng)上的MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行基因分型。使用MassARRAY系統(tǒng)對(duì)以下SNP和突變進(jìn)行基因分型：(1)SNP位點(diǎn)：SCN4A的rs571210585，HAPLN4的rs781390304，USP46的rs759572548，HTRA2的rs72470545，HS1BP3的rs11680700，DRD3的rs6280rs6280，SLO17603490的rs11280700，F(xiàn)US的rs387907274和rs751937417；(2)突變位點(diǎn)：KCNS2c. 1137T>A，NOS3c. 46G>A，NOS3c. 164C>T，F(xiàn)USc. 1129C>T，TENM4c. 158G>C，TENM4c. 1421C>A，TENM4c. 1553G>A，TENM4c. 3053G>A，TENM4c. 3412G>A，TENM4c. 4100C>A，TENM4c. 4324G>A，TENM4c. 4603A>C，TENM4c. 4895G>A，TENM4c. 5287G>A和TENM4c. 7353G>A。測(cè)定設(shè)計(jì)3.1軟件用于設(shè)計(jì)由MassARRAY測(cè)試的SNP的引物。這些SNP和突變的引物列于表1中，PCR的反應(yīng)系統(tǒng)列于表2中。

表1 經(jīng)測(cè)試的SNP和突變的引物

聚合物鏈反應(yīng)(PCR)基因單核苷酸多態(tài)性Forward Primer反向引物PCR反應(yīng)條件STK32BCTNNA3CTNNA3CTNNA3PPARGC1Ars10937625rs7903491rs10822974rs12764057rs17590046GTGCCCTTTATCTCCATCCCTAGGTGCTCTGATGTTGGGACCTCTCTAGGTTCTAAGGCCAATACGCAAGCCTGCACAAACAGTTGAGGTGTTGCAGAGCAGCGCTGTCAGCTCTGATTCTATTCTTGGGCTTCTTATGGGGACGGCCTAGATGTTACCGTGGGTGAATGAAACCAATTCCCGGAGCAAGTGGTCACCTGAA95 ℃ 2 min→95 ℃30 s→54 ℃ 30 s→72 ℃1 min→go to step 2for 35 times→72 ℃ 5 min

表2 PCR反應(yīng)系統(tǒng)

統(tǒng)計(jì)分析：使用SAS(9.4 TS1M2版本；SAS Institute Inc. ，Cary，NC)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。t檢驗(yàn)用于比較RLS/WED患者和非RLS/WED對(duì)照之間的年齡差異。卡方檢驗(yàn)用于評(píng)估RLS/WED與對(duì)照之間所有SNP分布的性別、Hardy-Weinberg平衡(HWE)、基因型和等位基因的差異。通過(guò)邏輯回歸進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析。計(jì)算出每個(gè)SNP或單倍型的比值比(OR)和95%的置信區(qū)間(CI)。同時(shí)，我們?cè)u(píng)估了顯性模型，隱性模型和顯性模型。通過(guò)Cochran-Armitage趨勢(shì)測(cè)試對(duì)加性模型進(jìn)行了測(cè)試。通過(guò)Haploview軟件(4.2版)測(cè)試了同一染色體中SNP的連鎖不平衡(LD)。Haploview還測(cè)試了單倍型以及1，000，000個(gè)排列檢驗(yàn)。R語(yǔ)言(版本3.3.1)用于通過(guò)Bonferroni方法校正p值。功效和樣本量計(jì)算(版本3.1.2)用于計(jì)算遺傳功效[18，19]。

功能預(yù)測(cè)：我們使用以下關(guān)鍵字搜索PubMed，Embase和EBSCO數(shù)據(jù)庫(kù)：“(Restless legs syndrome)AND(gene OR polymorphism)”。我們收集了在RLS/WED中發(fā)現(xiàn)的所有基因名稱。然后，我們使用以下關(guān)鍵字搜索“在線孟德?tīng)栠z傳在線”(OMIM)數(shù)據(jù)庫(kù)：“dopamine*”。我們將這些基因名稱識(shí)別為多巴胺相關(guān)基因。該數(shù)據(jù)庫(kù)，用于檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具(STRING)(版本10.5)用于預(yù)測(cè)新基因與RLS/WED的已知基因和多巴胺相關(guān)基因之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。我們通過(guò)注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID)(v6.8)進(jìn)行富集分析，評(píng)估新基因與RLS/WED的已知基因和多巴胺相關(guān)基因之間的可能關(guān)聯(lián)。

2 結(jié) 果

這項(xiàng)研究招募了130例RLS/WED患者和300例健康對(duì)照。9例RLS/WED患者因低鐵蛋白被排除在外。共有121個(gè)RLS/WED，最后招募了300個(gè)對(duì)照。RLS/WED患者與對(duì)照組之間在年齡和性別上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。家族性29例RLS/WED患者(23.97%)，女性63例RLS/WED患者(56.76%)(見(jiàn)表3)。

表3 病例和對(duì)照的人口統(tǒng)計(jì)表1病例和對(duì)照的人口統(tǒng)計(jì)信息

在SNP的相關(guān)研究中，年齡和性別匹配后在顯性或顯性模型中我們發(fā)現(xiàn)2個(gè)CTNNA3的SNP與RLS/WED有關(guān)聯(lián)的趨勢(shì)(rs10822974：OR=0.61，P=0.043，顯性模型；rs12764057：OR=1.76，P=0.020，顯性模型；OR=0.54，P=0.008，顯性模型)，但是Bonferroni方法校正P值后無(wú)顯著差異(見(jiàn)表4)。此外，我們也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CTNNA3中的單倍型與RLS/WED相關(guān)聯(lián)(見(jiàn)表5)。

表4 候選基因的SNP關(guān)聯(lián)以及比值比與RLS/WED風(fēng)險(xiǎn)

GeneSNPGenetic PowerRecessive Model (adjusted)bPOR95%CIOverdominant model (adjusted)bPOR95%CINumber of sample testedCaseControlCTNNA3DRD3LINGO1PPARGC1ASTK32BSLC1A2USP46rs7903491rs10822974rs12764057rs6280rs9652490rs11856808rs17590046rs10937625rs759572548rs37940870.0540.080.1340.1130.0660.1020.1280.1180.050.050.6910.3950.5720.60.0870.8520.9640.944-0.9440.891.251.250.885.870.94---0.960.49～1.620.75～2.100.57～2.730.55～1.410.77～44.690.48～1.85---0.33～2.780.8930.0430.0080.7550.2850.6720.1110.595-0.8241.030.610.541.080.770.90.620.86-1.130.65～1.640.38～0.990.34～0.850.67～1.740.47～1.250.57～1.440.34～1.180.50～1.49-0.40～3.20107114120115114117109118119112295280296294296298299290300280

在相關(guān)基因突變的研究中，我們發(fā)1例RLS/WED患者為TENM4的p.R1632H雜合子攜帶者，但該患者沒(méi)有出現(xiàn)臨床ET的癥狀，存在慢性持續(xù)性RLS/WED癥狀，家族史陽(yáng)性。在對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)TENM4的p.R1632H。我們?cè)趯?duì)照組和RLS/WED組中均未發(fā)現(xiàn)其他的突變位點(diǎn)。

旅游電子商務(wù)的不斷向前發(fā)展，越來(lái)越多的旅游電商企業(yè)加入到這一行列之中，但是大多數(shù)電商企業(yè)的盈利方式不清晰，只是一味的追尋多元化方向發(fā)展。一些新進(jìn)的電商企業(yè)為了吸引游客，往往會(huì)通過(guò)降低價(jià)格的方式打開(kāi)消費(fèi)者市場(chǎng)，大打價(jià)格攻堅(jiān)戰(zhàn)，使得旅游電商市場(chǎng)混亂不堪。即使一些做得比較好的旅游電商企業(yè),如攜程網(wǎng)，雖然在機(jī)票預(yù)訂和酒店預(yù)訂這兩個(gè)方面有著不俗的業(yè)績(jī)，相對(duì)來(lái)說(shuō)市場(chǎng)定位十分清晰有著自己的發(fā)展重點(diǎn)，但由于一些新進(jìn)入該行業(yè)的電商企業(yè)利用價(jià)格戰(zhàn)搶占市場(chǎng)份額，導(dǎo)致其盈利能力不斷下降。

使用先前給出的搜索方法，將336個(gè)基因用于以下生物信息學(xué)研究(見(jiàn)表6)。我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)使用DAVID和STRING工具在CTNNA3或TENM4與已知RLS/WED基因與多巴胺能途徑之間的已知相互作用。

表6 搜索了336個(gè)基因，可用于以下生物信息學(xué)研究

3 討 論

據(jù)我們所知，這是首次討論RLS/WED中原發(fā)性震顫的遺傳標(biāo)志物的研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)CTNNA3的rs10822974和rs12764057可能與RLS/WED超顯性模型相關(guān)。由CTNNA3編碼的蛋白質(zhì)屬于vinculin/α-catenin家族。CTNNA3可以通過(guò)免疫共沉淀分析直接結(jié)合β-catenin[20]。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的劑量可影響中腦多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生[21]。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)還可誘導(dǎo)小鼠脊髓和后腦底板中的神經(jīng)發(fā)生[22]。此外，CTNNA3還與免疫狀態(tài)異常有關(guān)，例如小兒食物過(guò)敏和哮喘[23～25]。免疫學(xué)異?？梢栽赗LS/WED患者中并不少見(jiàn)。IL1A和IL1B基因的多態(tài)性與RLS/WED相關(guān)[26]。某些自免性疾病患者群體中RLS/WED患病率較高，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病和多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病[27～29]。

TENM4與原發(fā)性震顫有關(guān)。使用少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和斑馬魚，TENM4突變的發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與軸突導(dǎo)向和中央髓鞘形成的調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。在小鼠中，TENM4的功能是誘導(dǎo)中胚層，后者在脊索中進(jìn)化[30]。此外，TENM4可能會(huì)影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的引導(dǎo)[31]。

我們的研究存在一些局限性。首先，中國(guó)RLS/WED的患病率相對(duì)較低，因此能夠招募的RLS/WED患者的數(shù)量很少。為了進(jìn)一步證實(shí)我們?cè)趤喼奕巳褐械陌l(fā)現(xiàn)，需要增加樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。RLS/WED中亞洲人和高加索人之間的遺傳背景不同[32]。所以，也希望也在高加索地區(qū)進(jìn)行類似的研究進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的關(guān)系。其次，我們的研究并未檢測(cè)到所有與震顫相關(guān)的必需基因突變或危險(xiǎn)SNP，例如SCN11A[33]。

我們的結(jié)果表明，CTNNA3和TENM4可能與中國(guó)南方人群的RLS/WED相關(guān)。希望將來(lái)有更多的亞洲人群RLS/WED隊(duì)列，繼續(xù)探索RLS/WED的致病基因。

縮略語(yǔ)

6-OHDA，6-羥基多巴胺

BLAST，基本局部比對(duì)搜索工具

CI，置信區(qū)間

DAVID，用于批注，可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)

DNA，脫氧核糖核酸

HWE，Hardy-Weinberg平衡

IRLSSG，國(guó)際RLS/WED研究小組

LD，連鎖不平衡

MPTP，N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶

NCBI，國(guó)家生物技術(shù)信息中心

OMIM，人類在線孟德?tīng)栠z傳

或，優(yōu)勢(shì)比

PCR，聚合物鏈反應(yīng)

RLS/WED，腿動(dòng)綜合征/Willis-Ekbom病

SAS，統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)

SNP，單核苷酸多態(tài)性

STRING，用于檢索相互作用的基因/蛋白質(zhì)的搜索工具