張 敏，向曉燕，江雪均，張景勍，劉穎菊、4

（1.重慶醫(yī)科大學藥學院2017級碩士研究生，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學藥學院重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016；3.廣州醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州 511436；4.重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016）

銀杏是一種落葉的多年生樹［1］，研究結果顯示銀杏葉、銀杏種子含有多種化學成分，其主要有效成分為黃烷醇糖苷、萜內(nèi)酯、銀杏酸、多糖、生物堿等［2］，可用于治療支氣管哮喘［3］、腦卒中［4］、高血壓［5］、高脂血癥［6］、阿爾茨海默氏癥［7］等，銀杏其他藥用部位（銀杏種仁等）也開始被開發(fā)利用起來。銀杏種仁（俗稱“白果”）除含有藥用成分外，還含有蛋白質(zhì)、維生素、脂肪［7］、胡蘿卜素等營養(yǎng)成分及微量元素［8］，可藥食兼用。白果也含有一些有害成分，如酚酸類化合物可以導致過敏［9］，4'-O-甲基吡哆醇會引起中毒［10］。酚酸化合物之一的銀杏酸除具有抗真菌，抗腫瘤等藥理作用特性外［11］，還具有胚胎毒性和細胞毒性等，限制了白果的應用，因此需要對白果進行加工處理，以控制其有害成分的含量。本研究用白果粉是以優(yōu)質(zhì)的白果為原料，經(jīng)先進的工藝技術加工制成的粉粒狀物，去除有毒成分，保留營養(yǎng)及有效成分。在文獻報道的白果藥理作用研究的基礎上，考察白果粉的抗疲勞和抗衰老作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡清潔級昆明小鼠，45只雄性，5只雌性，體質(zhì)量為（20±2）g；10個月齡清潔級昆明小鼠，體質(zhì)量30～35g，60只，雌雄各30只。許可證號SYXK（渝）2018-0003。由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。置于溫度（22±2） ℃，相對濕度50%～60 %，12 h循環(huán)照明的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.2 實驗試劑

D-半乳糖（北京鼎國昌盛生物科技有限公司，純度大于等于98 %），肝（?。┨窃ㄅ?0180122），全血乳酸試劑盒（批號20180503），血尿素氮（批號141318005），超氧化物歧化酶試劑盒（批號20180505），丙二醛試劑盒（批號20180504），單胺氧化酶測定試劑盒（批號20180504）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器

多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號VARIOSKAN LUX），低溫離心機（賽默飛世爾科技有限公司，型號ST 16R），MORRIS水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京科迪眾創(chuàng)有限公司）。

1.4 實驗藥物

白果粉（江蘇東臺捷爾銀杏科技有限公司，純度大于99 %）。白果粉制備工藝［12］為原料篩選→剝殼、去殼→漂洗、去皮衣→中間檢驗→磨漿、過濾→調(diào)漿、靜置→預糊化→脫水干燥→破碎、篩分→白果粉。白果粉混懸液的制備為分別稱取約1g、2g、3g白果粉置于3個燒杯中，分別往燒杯里緩慢加入20 mL蒸餾水，攪拌混勻，配成低、中、高濃度的白果粉混懸液，濃度分別為50 mg/mL、100 mg/mL和150 mg/mL，臨用前新配。

1.5 抗疲勞試驗

1.5.1 動物分組及給藥

4周齡雄性昆明小鼠40只，隨機分為白果粉3劑量組（2、4、6g/kg），正常對照組（Normal），每組10只。白果粉3個劑量組灌胃給予相應濃度的白果粉混懸液，正常對照組給予等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)28天。

1.5.2 小鼠爬桿實驗

有機玻璃棒（長40 cm，直徑8 mm）垂直固定于桌面，將小鼠置于有機玻璃棒頂端，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠從開始至雙前肢接觸桿底平臺的時間，第3次小鼠從玻璃棒頂端跌落時終止實驗，3次爬桿時間累計為總時間。

1.5.3 小鼠負重游泳實驗

最后一次給藥60 min后，在小鼠尾部綁上其體質(zhì)量5%的重物，放入40 cm水深玻璃水缸中，水溫為（30±1） ℃。記錄小鼠從開始游泳至頭部入水持續(xù)10 s不能浮出水面為止的時間，作為小鼠力竭游泳時間。

1.5.4 小鼠血乳酸、血尿素氮、肝（肌）糖原水平測定

負重游泳實驗結束后，撤去小鼠尾部的重物，將小鼠置于溫度為（30±1） ℃水中游泳90 min，眼眶采血，測定血乳酸和血尿素氮。處死小鼠后取肝臟和后腿部的肌肉，經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于測定肝（肌）糖原。

1.6 抗衰老實驗

1.6.1 動物分組及給藥

4周齡昆明小鼠10只和10個月齡昆明小鼠60只作為研究對象。10個月齡昆明小鼠，隨機分為6組（雌雄各30只），模型組、白果粉3個劑量（2g/kg、4g/kg、6g/kg）組、維生素E組（100 mg/kg）、衰老對照組每組10只，4周齡小鼠（雌雄各5只）為年輕對照組。各給藥組灌胃相應藥物，年輕對照組、衰老對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次。小鼠皮下注射1000 mg/kg D-半乳糖（每日1次）建立衰老模型，年輕對照組和衰老對照組皮下注射等體積生理鹽水（每日1次）。灌胃及造模均持續(xù)28天。

1.6.2 Morris水迷宮實驗

給藥最后1周，進行Morris水迷宮實驗。先進行定位航行實驗，測量小鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。在定位航行實驗中小鼠學會尋找平臺后，進行空間探索實驗，考察小鼠對平臺空間位置記憶的保持能力，操作步驟為撤掉平臺，在測試系統(tǒng)中設置原平臺位置為虛擬平臺。將每只小鼠依次置于第3象限入水，記錄其在120 s內(nèi)穿越虛擬平臺的次數(shù)。并記錄小鼠從入水到第1次穿越虛擬平臺的游泳軌跡圖。

1.6.3 體質(zhì)量記錄和胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)計算

小鼠飼養(yǎng)期間每3天記錄1次體質(zhì)量。

實驗結束后，取小鼠胸腺和脾臟，用4 ℃生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干水分，稱重，計算小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，計算公式如下：

臟器指數(shù)（g/g）=臟器質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%

1.6.4 血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA）和腦單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）水平測定

末次給藥后，小鼠禁食，自由飲水，24 h后，采血，低溫離心后取上層血清，-80 ℃保存。處死小鼠后，取小鼠大腦，生理鹽水洗凈并濾干，-80 ℃保存，待測定時制備成10%的組織勻漿，按照試劑盒測定血清SOD、MDA和腦MAO。

1.7 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，若方差齊，組間比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 抗疲勞實驗

2.1.1 白果粉對小鼠體質(zhì)量的影響

白果粉給藥期間，各組小鼠體質(zhì)量變化趨勢相同。表明白果粉對小鼠體質(zhì)量無不良影響。

2.1.2 白果粉對小鼠負重游泳和爬桿時間的影響

如表1所示，白果粉能夠增加小鼠負重游泳和爬桿時間。白果粉各劑量組均延長了小鼠的負重游泳時間和爬桿時間，其中白果粉高劑量組小鼠的負重游泳時間和爬桿時間分別較正常對照組小鼠提高了約1.46和4.03倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05），表明白果粉能增加小鼠的運動耐力。

表1 白果粉對小鼠負重游泳和爬桿時間的影響 （±s）

表1 白果粉對小鼠負重游泳和爬桿時間的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01。

組別 例 負重游泳時間（s） 爬桿時間（min）正常對照組 10 361.25± 11.47 2.01±0.60白果粉低劑量組 10 504.20± 50.19 2.86±0.76白果粉中劑量組 10 397.17± 67.06 4.09±0.86白果粉高劑量組 10 889.33±116.41△△ 10.13±2.05△

2.1.3 白果粉對小鼠血液生化參數(shù)和糖原的影響

如表2所示，與正常對照組比較，白果粉中、高劑量組都可以減少小鼠運動后血乳酸的產(chǎn)生，且高劑量組乳酸堆積量較正常對照組低（P＜ 0.05）；白果粉對血尿素氮未產(chǎn)生明顯影響作用；白果粉能提高小鼠肝糖原和肌糖原含量，其中高劑量組小鼠的肝糖原和肌糖原含量與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），分別較正常對照組增加了約1.98和2.10倍。說明白果粉增加了小鼠的能量儲備，可延緩機體疲勞的發(fā)生。

表2 白果粉對小鼠血液生化參數(shù)和糖原的影響 （±s）

表2 白果粉對小鼠血液生化參數(shù)和糖原的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01。

肌糖原/（mg/g）正常對照組 10 5.66±3.30 11.63±1.57 1.76±0.61 0.46±0.18白果粉低劑量組 10 5.90±1.19 13.02±1.35 2.54±1.25 0.92±0.23白果粉中劑量組 10 3.99±1.15 10.71±1.31 2.47±0.80 0.69±0.31白果粉高劑量組 10 0.86±0.51△ 13.67±2.49 5.24±0.98△ 1.43±0.46△△組別 例 血乳酸/（mmol/L）血清尿素氮/（mol/L）肝糖原/（mg/g）

2.2 抗衰老實驗

2.2.1 白果粉對衰老小鼠空間位置記憶保持能力的影響

小鼠空間探索軌跡圖和穿越虛擬平臺次數(shù)結果顯示，與年輕對照組和衰老對照組比較，模型組小鼠穿越平臺次數(shù)減少，空間探索軌跡的趨向性變差。白果粉中、高劑量組可以改善小鼠運動的趨向性和尋找平臺的準確性，其中白果粉中劑量組穿越虛擬平臺次數(shù)較模型組多（P＜0.05），使小鼠空間位置記憶保持能力增強。表明白果粉可以改善衰老小鼠的空間學習記憶能力。

表3 Morris水迷宮小鼠穿越虛擬平臺次數(shù) （±s）

表3 Morris水迷宮小鼠穿越虛擬平臺次數(shù) （±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05。

組別 例 穿越虛擬平臺次數(shù)（次）年輕對照組 10 1.91±1.08衰老對照組 10 1.75±1.48模型組 10 0.67±0.75維生素E組 10 1.22±1.23白果粉低劑量組 10 0.67±0.82白果粉中劑量組 10 1.50±0.67△白果粉高劑量組 10 1.67±1.49

2.2.2 白果粉對衰老小鼠體質(zhì)量的影響

白果粉給藥期間，年輕對照組小鼠體質(zhì)量呈增長的趨勢，且變化速度較衰老小鼠體質(zhì)量變化速度快。模型組小鼠體質(zhì)量比衰老對照組略低，陽性藥物組和白果粉低、中劑量組小鼠的體質(zhì)量較模型組略高，白果粉高劑量組小鼠體質(zhì)量較衰老小鼠偏低，有下降的趨勢。

2.2.3 白果粉對衰老小鼠臟器指數(shù)和生化指標的影響

如表4所示，與年輕對照組比較，衰老對照組和模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低。與模型組小鼠比較，白果粉各劑量組均能延緩脾臟、胸腺指數(shù)減小。表明白果粉能維持機體的免疫功能，發(fā)揮一定的抗衰老作用。衰老對照組和模型組小鼠血清MDA含量增加、腦MAO活性上升，氧自由基增多，機體受到氧化損傷而發(fā)生衰老。白果粉使小鼠血清MDA含量和腦MAO活性均低于模型組，低劑量組腦MAO活性顯著下降（P＜0.05）。白果粉低、中、高劑量組小鼠的血清SOD活性較模型組均有提高。結果表明，白果粉通過抗氧化作用能夠緩沖氧自由基對機體造成的傷害，主要通過減少氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生和抑制腦MAO活力。

表4 白果粉對衰老小鼠臟器指數(shù)和生化指標的影響 （±s）

表4 白果粉對衰老小鼠臟器指數(shù)和生化指標的影響 （±s）

注： 與模型組比較，△P＜0.05。

組別 例 脾臟指數(shù)（%） 胸腺指數(shù)（%） 血清SOD（U/mL） 血清MDA（umol/L） 腦MAO（U/mgprot）年輕對照組 10 0.38±0.07 0.28±0.04 6708.33±221.57 1.52±0.38 11696.99±1138.71衰老對照組 10 0.26±0.06 0.17±0.03 6189.00±369.29 2.14±0.50 13034.27± 624.87模型組 10 0.24±0.07 0.11±0.03 6279.88±484.19 2.47±0.96 15594.56±1351.67維生素E組 10 0.26±0.05 0.12±0.04 6745.87±167.93△ 1.83±0.35 14852.41±1096.56白果粉低劑量組 10 0.28±0.08 0.14±0.05 6838.13±545.09 1.73±0.46 13188.91±1172.92△白果粉中劑量組 10 0.34±0.09 0.11±0.03 6890.36±384.43 1.61±0.49 13424.77±1506.87白果粉高劑量組 10 0.28±0.04 0.14±0.03 6623.51±362.37 1.72±0.48 13742.84± 848.71

3 討 論

運動性疲勞是指機體生理過程不能維持其機能在一定水平上和（或）不能維持預定運動強度的狀態(tài)［13］。衰老是一種復雜的自然現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞和組織結構和功能的退化性改變。D-半乳糖通過增加氧化應激、細胞凋亡、炎癥和神經(jīng)調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏和抗氧化酶減少等機制損害認知功能，而常用于嚙齒動物來模擬自然衰老［14］。研究結果顯示，白果粉具有在疲勞模型中增加小鼠的運動耐力，在衰老模型中增強小鼠的空間位置學習記憶保持能力、減輕氧化損傷和延緩免疫器官萎縮的作用。具體表現(xiàn)為使小鼠爬桿和負重游泳時間延長，降低高強度游泳運動中血乳酸水平，并增加肝糖原和肌糖原的儲存量。此外，白果粉改善了衰老小鼠在Morris水迷宮實驗中尋找平臺的能力，延緩了胸腺、脾臟等免疫器官臟器指數(shù)的減小，使小鼠體內(nèi)SOD水平升高，并降低了腦MAO活力和細胞膜過氧化終產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生?？蛊谧饔玫闹苯恿慷仁沁\動耐力的增加［15］，小鼠運動耐力可通過負重力竭游泳實驗和爬桿實驗等直觀反映［14］。血尿素氮是評估機體對高強度運動負荷的承受能力的敏感指標，研究結果顯示白果粉對血尿素氮水平未產(chǎn)生明顯影響。乳酸是肌肉在進行高強度運動時，從厭氧糖酵解途徑獲得足夠能量的同時產(chǎn)生的副產(chǎn)物，過量乳酸清除的主要途徑是用于補充肌肉糖原和在肝臟中通過糖異生將其轉化為葡萄糖，然后被保存為肝糖原；運動所需的能量最初來自糖原分解，后來來自肝臟釋放的循環(huán)糖原。因此本研究結果中乳酸水平降低和肝、肌糖原的儲存量增加有利于增強耐力和運動能力［16］，與負重力竭游泳和爬桿實驗結果一致。通過Morris水迷宮實驗來評判白果粉對衰老小鼠的認知障礙是否有所改善［17］。氧自由基產(chǎn)生增加導致氧化應激是產(chǎn)生衰老的主流學說，SOD作為生物體內(nèi)存在的天然抗氧化酶能夠清除體內(nèi)氧自由基，MDA是氧自由基作用于生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，可引起組織和器官衰老，腦MAO活性增加會加快神經(jīng)系統(tǒng)的老化。免疫功能下降是生物體衰老的重要表現(xiàn)形式［18］，胸腺、脾臟的臟器指數(shù)是反應大體形態(tài)的重要指標，而器官形態(tài)在一定程度上可以反映機體免疫器官的功能狀態(tài)［18］。

白果粉具有抗疲勞和抗衰老的作用。