王 騫，張 群，郭銘暉，王 碩，李雁冰，黃大鵬，魏國生，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

1 抗氧化劑作用機(jī)制

抗氧化劑的抗氧化作用機(jī)制有很多種，例如：自由基的吸收劑、氧清除劑、過氧化物分解劑等。首先，抗氧化劑可以抑制自由基產(chǎn)生，并且與已產(chǎn)生的游離的自由基結(jié)合反應(yīng)。另外通過提高抗氧化酶活性，降低ROS含量[1]。同時(shí)一些抗氧化劑的還原電位非常低，是氫和中子的給予者，其能在氧化還原反應(yīng)中與體內(nèi)產(chǎn)生的ROS形成非常穩(wěn)定的酚氧自由基，進(jìn)而阻止精子受氧損傷。超氧自由基在多數(shù)的氧自由基中，都有直接消除自由基的作用，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶的活力，具體抗氧化作用如圖1所示。

2 抗氧化劑的種類

2.1 酶類抗氧化劑

抗氧化劑是阻止氧化不良影響的物質(zhì)，它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而去除自由基對細(xì)胞及精子損害的物質(zhì)。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）是精子體內(nèi)精漿和線粒體中必不可少的最基本的抗氧化劑[2]。超氧化物歧化酶通過催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫來保護(hù)精子免受超氧化物陰離子的侵害，從而防止過氧化脂質(zhì)（lipoperoxides，LPO）并提高精子運(yùn)動(dòng)能力。過氧化氫酶可以推進(jìn)過氧化氫的分解，使其分解成水和氧氣。所以超氧化物歧化酶和過氧化氫酶都有助于降低精子的氧化損傷程度[3]。

2.2 維生素類抗氧化劑

2.2.1 維生素E

維生素E（α-生育酚）是一種在精子細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)的斷鏈型抗氧化劑，它的作用機(jī)制不是通過清除自由基來避免脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而是通過中和過氧化氫和淬滅自由基來發(fā)揮作用，從而阻止鏈反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物并保護(hù)膜免受ROS誘導(dǎo)的損傷。維生素E是一種脂溶性物質(zhì)，它不溶于水，易溶于丙酮等有機(jī)溶質(zhì)[4]。在冷凍保存過程中，補(bǔ)充維生素E對精子活力、線粒體膜電位和膜完整性有積極作用，具體取決于精子的比例。朱廣琴等[5]研究表明：綜合各項(xiàng)指標(biāo)后表明以質(zhì)量濃度為400 μg/mL維生素E組的效果最好。

2.2.2 維生素C

維生素C是一種水溶性維生素，能清除活性氧，發(fā)揮抗氧化作用，提高精子凍融后的精液質(zhì)量。權(quán)富生等[6]研究表明，在無角道塞特綿羊精液的冷凍保存中，稀釋液中添加維生素E、維生素C進(jìn)行精液冷凍，均對冷凍精子起到了保護(hù)作用。維生素E可以當(dāng)作首選抗氧化添加劑，它可以提高精子的成活率和頂體的完整度。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)添加4.4 mg/mL的維生素C，精子的成活率可以達(dá)到（37.98%）。黃俻華等[7]研究表明，冷凍稀釋液中添加600μg/mL的維生素C或維生素E可以顯著提高陸川豬精液冷凍保存效果。添加600 μg/mL的維生素C時(shí)，精子的存活時(shí)間可以達(dá)到113.18 h，活力可以達(dá)到42.88%。添加600 μg/mL的維生素E時(shí)，精子的存活時(shí)間可以達(dá)到120.24 h，活力可以達(dá)到42.97%。

2.2.3 維生素P

維生素P（別名蘆?。┦且环N水溶性維生素，它主要由柑橘屬生物類黃酮、蕓香素和橙皮素構(gòu)成的。復(fù)合維生素C中一般都含有維生素P，也是水溶性的。劉亞偉等研究表明，維生素P的添加顯著延長了豬精子低溫保存時(shí)間，在第6天和第9天時(shí)，加入160 μg/mL和20 μg/mL的維生素P，豬精子的活力、活率、頂體完整率和低滲透壓率都有了顯著地提高。因此，在各試驗(yàn)組中，維生素P的最適添加濃度為160 μg/mL[8]。

2.3 卵黃

卵黃是一種起保護(hù)作用的添加劑，一般在稀釋液中添加20%含量的雞卵黃對豬精的冷凍保存有保護(hù)作用。它可以在精液冷凍-解凍時(shí)保護(hù)精液在冷熱交換的環(huán)境中減少精子受到低溫打擊，它也被證明為是一種有效的增量劑，因?yàn)樵诼腰S本身的質(zhì)量中發(fā)現(xiàn)了和精子生存環(huán)境相似的脂質(zhì)。由于存在磷脂（卵磷脂）和低密度脂蛋白，它們也可以保護(hù)精子在冷凍融化過程中減少冷沖擊。添加卵黃時(shí)最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，卵黃的使用很看重環(huán)境和衛(wèi)生的情況，還要考慮是否會(huì)產(chǎn)生有害的代謝、毒素和感染微生物病毒等風(fēng)險(xiǎn)。張美娜等[9]研究表明這些因素的產(chǎn)生都會(huì)影響精子的質(zhì)量，會(huì)使精子的質(zhì)量下降，降低精子授精的能力。韓飛等[10]在卵黃離心及精液透析預(yù)處理對豬精子冷凍效果的影響的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，卵黃進(jìn)行離心處理及采用透析方法對豬精液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的凍前預(yù)處理均能明顯改善精子的冷凍效果，雖然方法有明顯的效果，也需不斷更新完善。

2.4 褪黑素

褪黑素（Melatonin，MLT）是由動(dòng)物松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，存在于精子形成的各個(gè)階段，也存在于動(dòng)物其他的組織和細(xì)胞中[11]。在精液中加入適量的褪黑素能減輕氧化作用對精子線粒體造成的損傷，提高精子在體外存活的時(shí)間與活力。吳大平等[12]研究結(jié)果表明，采用0.4 mg/mL 維生素E+0.2 mg/mL MLT或0.2 mg/mL MLT+0.1 mM 谷胱甘肽（GSH）的組合添加劑對地中海水牛精液冷凍保存可取得較好效果。褪黑素具有極高的脂溶性和水溶性，MLT有強(qiáng)大的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)活性和清除自由基抗氧化能力，可能會(huì)成為新的抗病毒治療的方法和途徑。胡靚華等[13]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素適量增加（濃度為20 mg/L 為最適濃度）可以提高精液的質(zhì)量，使精子的活力、頂體的完整率、質(zhì)膜的完整性上都比添加維生素類時(shí)顯著，同時(shí)丙二醛（malonaldehyde，MDA）降低，這說明褪黑素對精子的保存具有積極意義，能夠減少 ROS 產(chǎn)生，并保護(hù)精子[14]。

2.5 ?；撬?/h3>

牛磺酸（Taurine，Tau）是動(dòng)物體內(nèi)的一種結(jié)構(gòu)簡單的含硫氨基酸，也是一種被廣泛應(yīng)用的自由氨基酸。李方方等[15]對24頭年齡、體況都相同的約克夏種公豬進(jìn)行對照試驗(yàn)，證實(shí)連續(xù)飼喂46～90 d?；撬峥梢燥@著提高公豬精漿SOD的活力，適宜濃度水平為6 g/kg，總體提高了精液的抗氧化能力。朱宇旌等[16]的研究證實(shí)在公豬日糧中添加N-氨甲酰谷氨酸（N-Carbamylglutamate，NCG）、Tau可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高精漿抗氧化性能，從而提高精液品質(zhì)。在NCG+Tau組，加白蛋白1.40%～1.66%、免疫球蛋白11.28%～12.68%、總蛋白16.35%～18.05%它們有互作效應(yīng)，推薦二者共同添加。

3 抗氧化劑在豬精液保存中的應(yīng)用

滲透壓、理化應(yīng)激和凍融溫度變化等不同的因素都會(huì)影響精液質(zhì)量參數(shù)，例如：生存力、膜完整性和運(yùn)動(dòng)性[17]。目前，牛凍精的實(shí)驗(yàn)是比較成熟的一類實(shí)驗(yàn)，在這一實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，人們開始不斷嘗試不同物種的凍精技術(shù)，由于豬精子“冷休克”比較嚴(yán)重，冷凍、解凍后精子的活力會(huì)比較低[18]，研究豬冷凍精液稀釋液，更好地保存精子免受冷凍損傷，使精液冷凍的操作程序標(biāo)準(zhǔn)化，是人們?yōu)榱颂岣呷斯な诰Ч瓿傻氖滓蝿?wù)[19]。李方舟[20]在添加蘋果多酚與葡萄籽原花青素對山羊精液低溫保存效果的研究中表示，山羊精液低溫保存中，一定濃度組合的兩種抗氧化劑蘋果多酚與葡萄籽原花青素對精液的保存效果高于單獨(dú)添加兩種抗氧化劑效果，其中以蘋果多酚與葡萄籽原花青素組合濃度為20～30 mg/L時(shí)對山羊精液低溫保存效果最優(yōu)。添加劑在精子的活力、存活率及運(yùn)動(dòng)性、頂體和膜完整性等質(zhì)量參數(shù)的維持方面起著至關(guān)重要的作用。侯震坤等[21]在淫羊藿苷對關(guān)中黑豬精液常溫保存效果的研究中，在使用淫羊藿苷替代部分慶大霉素添加于精液稀釋劑中時(shí)，對于精液活率、活力和頂體完整性均具有一定保護(hù)作用，且能夠起到抑制精液中細(xì)菌生長的作用。陳美杰等[22]研究表明在稀釋液中添加40 μmol/L的迷迭香酸能達(dá)到最佳精液保存效果，顯著提高了豬精子活率、質(zhì)膜和頂體完整率、總抗氧化能力、SOD活性、ATP含量、線粒體膜電位和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性，并顯著降低丙二醛含量，精子活率可達(dá)到66.47%。

4 小結(jié)與展望

隨著科技不斷地進(jìn)步，科研人員也不斷地嘗試豬冷凍精液保存技術(shù)上新的突破。精液的冷凍保存可以有效地解決精液在不同的環(huán)境下保存時(shí)間的長短，也可以在疾病控制方面得到保障和國內(nèi)外公豬的引進(jìn)上有所提高幫助。由于凍精可以使優(yōu)良基因得到無限期的保存，延長公豬的使用年限，而不受公豬死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為地使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，獲得更大的遺傳進(jìn)展。因此，精液的冷凍保存一直是人們不斷嘗試不斷更新的一項(xiàng)試驗(yàn)。雖然凍精近幾年在豬的試驗(yàn)上已有了巨大的突破，但是和牛、羊相比還是有較大的差距，最重要的原因就是豬的射精量大，精子對低溫極其敏感，實(shí)現(xiàn)高效冷凍有一定的難度，希望在未來研究和發(fā)展中，豬精液的冷凍保存可以達(dá)到理想的效果。