摘 要：通過煙曲霉利用農(nóng)作物秸稈對果樹生產(chǎn)安全應(yīng)用的可行性進(jìn)行闡述，在增加土壤肥力、防治果樹病蟲害、治理果園環(huán)境污染3個方面具有的潛在應(yīng)用價值進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞：煙曲霉;果樹;安全應(yīng)用;秸稈

文章編號：2096-8108（2020）03-0065-04?中圖分類號：S66?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract：The feasibility of using crop straw by Aspergillus fumigatus in the production and safety of fruit trees was discussed. It is potentially used for increasing soil fertility， controlling crop diseases and decreasing agricultural environmental pollution.

Keywords：Aspergillus fumigates; Fruit tree; Safe application; Crop straw

長期以來，化肥、農(nóng)藥和薄膜是果農(nóng)實現(xiàn)增產(chǎn)增收的重要手段，病蟲害是影響果樹生產(chǎn)的一個重要問題。目前，過度施肥、殘留高劑量農(nóng)藥、白色污染或是秸稈焚燒都會影響地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品銷售的信譽(yù)和口碑。因此，防治果樹病蟲害、治理果樹環(huán)境污染和提高農(nóng)作物秸稈利用率意義重大。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是在世界范圍內(nèi)廣泛存在的一類真菌，耐鹽，耐高溫（30～40 ℃），遺傳性狀穩(wěn)定。早在20世紀(jì)40年代，已經(jīng)有報道列出從煙曲霉代謝中分離到的一種物質(zhì)煙曲霉酸（Fumigacin）可以作為殺菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]，這種殺菌劑來源天然，研究認(rèn)為能阻斷病原真菌蛋白質(zhì)合成[2]。多年來，煙曲霉的應(yīng)用一直有文獻(xiàn)報道，已證明對果樹生產(chǎn)環(huán)境中的有機(jī)質(zhì)[3]、殘留農(nóng)藥污染[4-6]、廢棄農(nóng)用薄膜污染[7]和蒽污染[8]均有很好地降解作用。利用煙曲霉高效的生物降解能力及其次生代謝產(chǎn)物的高生物活性，以再利用的農(nóng)作物秸稈作為碳氮源制成的煙曲霉具有潛在的應(yīng)用價值。

1?果樹生產(chǎn)的安全性

1.1?活體煙曲霉的鑒定

煙曲霉是否安全，首先要對果樹內(nèi)的真菌進(jìn)行培養(yǎng)分離鑒定。煙曲霉活體菌株的檢測方法主要以真菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段進(jìn)行。

不同地區(qū)的煙曲霉在真菌形態(tài)學(xué)上趨于一致：致密圓柱形的分生孢子頭、頂囊的形狀和分生孢子的特征，因此基于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上的菌落生長形態(tài)、顏色、顯微形態(tài)以及色素形成等情況，在加上通過鏡檢可以基本判斷適合一些像煙曲霉比較常見的菌株。平板培養(yǎng)觀察煙曲霉菌落有輻射狀皺紋，非標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲根據(jù)底物營養(yǎng)不同，呈青黃色到煙土色不一。鏡檢下，煙曲霉產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)有類似的傘狀結(jié)構(gòu)，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，菌絲有隔，分生孢子球形。孢子體積較小，在空氣中易飄散，普通光學(xué)顯微鏡須在放大1 000倍（100×10）下能夠清楚觀察到孢子形態(tài)。這樣的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法觀察則比較簡單方便。

利用分子生物學(xué)檢查也是目前最常用的手段，菌株的鑒定不會受到實驗人員的經(jīng)驗水平影響，比較客觀[9]。并且煙曲霉基因序列相對保守[10]，一般采用rDNA-ITS序列分析即可鑒定菌種。

1.2?次生代謝產(chǎn)物的安全性

煙曲霉活體菌株鑒定雖然解決的菌種定性的問題，但無法區(qū)分是否為帶毒菌株。煙曲霉有毒的次生代謝產(chǎn)物多以震顫真菌毒素（Verruculogen）、煙曲霉震顫素B（Fumitremorgin B）、膠毒霉素（Gliotoxin）等為標(biāo)志化合物，這些代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)獨特，利用色譜、光譜和質(zhì)譜技術(shù)定性分析，或利用核磁共振技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，可作為帶毒菌株的定性分析，但使用和維護(hù)費用較為昂貴。

目前，真菌毒素在食品原料和（或）食品成品可食用部分中允許的最大含量水平在0.5～60 μg/kg[11]。以煙曲霉中的膠毒霉素為例，其產(chǎn)量約在15 mg/L[12]，控制水量稀釋800～1 000倍制成對有助于保證次生代謝產(chǎn)物在果樹生產(chǎn)的安全性。

1.3?生產(chǎn)環(huán)境的安全性

煙曲霉一直被認(rèn)為對人和牲畜較為危險的致病真菌[13]，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)常用于曲霉病發(fā)病機(jī)制的模型建立[14，15]，但從果樹生產(chǎn)環(huán)境的角度看，作為天然存在的菌種，煙曲霉其本身是被投放在湖水中，已證明結(jié)果較為安全[16]。從果樹本身角度看，煙曲霉作為植物內(nèi)生菌群之一，在正常生長的農(nóng)作植物中能夠分離得到煙曲霉[17]。果樹生產(chǎn)環(huán)境相對開放，并且在煙曲霉在植株生長中并未有明顯的毒害作用，同時作為非靶生物的人和牲畜一般認(rèn)為是在低抵抗力的情況下受到煙曲霉孢子侵犯得病[18]，使得煙曲霉在果樹生產(chǎn)上的安全利用存在可操作性。

2?農(nóng)作物秸稈再利用

2.1?煙曲霉的馴化和保存

煙曲霉對農(nóng)作物秸稈生物轉(zhuǎn)化能力比較強(qiáng)，可采用菌株馴化篩選的方法[19]，將察氏固體培養(yǎng)基中的碳源蔗糖（或葡萄糖）按比例逐步兌換為果樹秸稈粉，將最后用純農(nóng)作物秸稈粉培養(yǎng)的煙曲霉作為種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基其他成分可采用察氏固體培養(yǎng)基配方，進(jìn)行至少90 d的固體培養(yǎng)。當(dāng)固體培養(yǎng)基至瓶內(nèi)顏色開始出現(xiàn)青色時，將其作為原菌種封口冷凍保存。

2.2?煙曲霉的擴(kuò)大培養(yǎng)

活化的固體培養(yǎng)基可以轉(zhuǎn)接菌絲和基質(zhì)到裝有培養(yǎng)液，培養(yǎng)液成分除瓊脂外與種子培養(yǎng)基保持一致，參考條件控制在30 ℃以上，轉(zhuǎn)速120 rpm以上，培養(yǎng)至少30 d以上，以獲得母液。培養(yǎng)初期液體培養(yǎng)基呈白色或淡黃色，菌體形狀不規(guī)則但明顯，隨著培養(yǎng)時間增加，色素慢慢累積呈青綠色，培養(yǎng)基液體顏色也呈現(xiàn)黃色。通過母液多批次接種獲得成規(guī)模煙曲霉培養(yǎng)液，每批次培養(yǎng)至少30 d以上，待菌團(tuán)或菌絲變大變多后，采用3層紗布過濾獲得。

2.3?煙曲霉的性狀特點

將煙曲霉用水稀釋800～1 000倍，制得煙曲霉，現(xiàn)配現(xiàn)用。該制劑呈淡黃色，包含煙曲霉孢子、菌絲體和秸稈顆粒等不溶物。煙曲霉中代謝產(chǎn)物主要活性成分為小分子生物堿[20]和有機(jī)酸[21]，因此可通過紫外-可見光分光光度計測定總生物堿[22]和有機(jī)酸[23]的含量。

3?潛在應(yīng)用價值

3.1?增加土壤肥力

煙曲霉可以以農(nóng)作物秸稈粉為底物，煙曲霉發(fā)酵得到代謝產(chǎn)物。煙曲霉的原料底物秸稈中含有碳、氮、磷、鉀等元素，通常情況下纖維素、半纖維素和木質(zhì)素難以短時間降解，并且若直接在田間腐熟，未完全腐熟情況下容易產(chǎn)生大量病菌和蟲卵;煙曲霉能產(chǎn)生多種酶，如纖維素酶、木聚糖酶、淀粉糖化酶和β-1，6-葡聚糖酶等，對稻草[24]、玉米[25]、棉[26]等果樹秸稈均能作為碳源利用和降解。

3.2?減少果樹病蟲侵害

煙曲霉中存在對稻瘟病、紋枯病或赤星病病原真菌有抑菌效果的生物堿和有機(jī)酸，包括煙曲霉酸、12β-羥基-13α-甲氧基黃霉素TR-2、震顫真菌毒素和煙曲霉震顫素B等，這些次生代謝產(chǎn)物在實驗室條件下的抗病效果均與廣譜殺菌劑多菌靈（Carbendazim）或惡霉靈（Hymexazol）相當(dāng)[27]。另外，煙曲霉中存在煙曲霉誘導(dǎo)的胞外幾丁質(zhì)酶，也可能產(chǎn)生意想不到的效果[28]。目前，商品化的幾丁質(zhì)殺蟲劑Clandosan在美國已經(jīng)應(yīng)用于園藝植物。該產(chǎn)品宣傳可以促進(jìn)土壤微生物產(chǎn)生一種殺死線蟲和蟲卵的幾丁質(zhì)酶，以致殺滅根瘤線蟲（Meloidogyne spp.）[29]。而煙曲霉本身能夠分泌幾丁質(zhì)酶，因此，施用煙曲霉在土壤中可能有直接防治害蟲或者與其他微生物協(xié)同防治的潛力。

3.3?降低果樹環(huán)境污染

煙曲霉中存在低劑量煙曲霉孢子和菌絲可能起到煙曲霉的生物降解作用。在實驗室條件下已經(jīng)證明煙曲霉對甲胺磷[4]、阿特拉津[5]、西瑪津[5，6]等農(nóng)藥有降解能力，并且能夠降解小分子聚乙烯薄膜殘體，在“光照+煙曲霉”綜合降解模式下可縮短農(nóng)用薄膜的降解周期[7]。

4?展望

煙曲霉有毒次生代謝產(chǎn)物多為環(huán)境因素影響。比如在高濃度氯化鈉脅迫條件下，煙曲霉代謝大量產(chǎn)生膠毒霉素（Gliotoxin）[12]。一方面，通過去毒提取工藝和產(chǎn)毒機(jī)理研究，可以提高利用煙曲霉的安全性。如何讓煙曲霉本身減毒或是通過層析等分離方法將其去毒，這需要嘗試。比如采用兩步發(fā)酵制有機(jī)肥法，

第1步采用煙曲霉處理底物，第2步采用其他菌株處理煙曲霉代謝產(chǎn)物，這是一種很好的減毒探索方法[30]。再比如可以通過基因敲除、紫外誘變或抗性篩選尋找弱毒菌株，也是未來發(fā)揮高濃度煙曲霉高酶活和次生代謝產(chǎn)物的研究途徑。另一方面，稀釋倍數(shù)有利于避免微生物危險[31]，保證對環(huán)境相對親和，為田間試用提供實際操作的可能。煙曲霉基于生化特點，以往煙曲霉基本處于配角中，比如有機(jī)肥中添加適量煙曲霉發(fā)酵被認(rèn)為是有助于制備新的生物有機(jī)肥[32];空氣中帶有煙曲霉孢子的混合菌種出現(xiàn)在我國某些傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中如某些釀酒、豆豉、腐乳中[33]。煙曲霉與人類的關(guān)系密切，需要理性看待其危害，其本身的經(jīng)濟(jì)價值尚待我們開發(fā)。

參考文獻(xiàn)

[1]Gilliver K. The inhibitory action of antibiotics on plant pathogenic bacteria and fungi[J]. Annals of Botany， 1946， 10（39）：271-282.

[2]Shinohara C， Hasumi K， Endo A. Inhibition of oxidized low-density lipoprotein metabolism in macrophage J774 by helvolic acid[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Lipids and Lipid Metabolism， 1993， 1167（3）：303-306.

[3]劉?可，王遠(yuǎn)宏，常若葵，等. 促秸稈腐熟真菌篩選實驗初報[J].浙江果樹科學(xué)，2018，59（11）：2129-2131，2134.

[4]董愛榮，張?德. 降解甲胺磷的土壤真菌多樣性及降解效率[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，41（10）：122-123.

[5]Kaufman D D， Blake J. Degradation of atrazine by soil fungi[J].Soil Biology and Biochemistry， 1970， 2（2）：73-80.

[6]Kearney P C， Kaufman D D， Sheets T J. Fungal metabolism of herbicides， metabolites of simazine by Aspergillus fumigatus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1965， 13（4）：369-372.

[7]李風(fēng)珍，鄭鴻元，劉增柱，等. 可控光降解聚乙烯薄膜的微生物降解[J]. 環(huán)境科學(xué)，1990，11（1）：6-11.

[8]強(qiáng)婧，尹?華，彭?輝，等. 蒽降解菌煙曲霉A10的分離及降解性能研究[J]. 環(huán)境科學(xué)，2009，30（5）：1298-1305.

[9]馬愛瑛，張?琇，劉曉飛. 一株產(chǎn)蝦青素酵母菌株的鑒定[J]. 生物技術(shù)通報，2010（11）：234-237.

[10]Galagan J E， Calvo S E， Cuomo C， et al. Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A. fumigatus and A. oryzae[J]. Nature， 2005（438）：1105-1115.

[11]GB 2761-2017，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量[S].

[12]朱雙雙，湯逸飛，阮川芬，等.黃花蒿內(nèi)生真菌SPS-02的鑒定和次生代謝產(chǎn)物研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2016，28（4）：519-524.

[13]王?志. 人畜共患真菌?。ㄏ拢J].中國獸醫(yī)雜志，1988，14 （4）：9-50.

[14]劉婷婷，戴?璐，王綠婭，等. 煙曲霉提取物誘導(dǎo)小鼠哮喘模型的建立[J]. 心肺血管病雜志，2015（2）：137-140.

[15]辛?娜，吳躍剛，并發(fā)紅，等. 煙曲霉提取物對人支氣管上皮細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子濃度的影響[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（24）：3289-3291.

[16]郭丹釗，陳?鈞. 煙曲霉SL-30菌株對非靶生物的安全性觀察[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2013，31（4）：293-297.

[17]Zhang H W， Tang Y F， Ruan C F， et al. Bioactive secondary metabolites from the endophytic Aspergillus genus[J]. Records of Natural Products， 2016， 10（1）：1-16.

[18]Tekaia F， Latgé J P. Aspergillus fumigatus：saprophyte or pathogen？[J]. Current opinion in microbiology， 2005， 8（4）：385-392.

[19]李?樂，李明星，湯國雄，等. 一株纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選與產(chǎn)酶特性研究[J]. 環(huán)境科技，2019，32（1）：24-29.

[20]林長幸，曾東強(qiáng)，唐文偉. 源于植物內(nèi)生真菌的農(nóng)藥活性成份研究[J]. 廣西植保，2018（3）：26-29.

[21]王愛玉，吳曉玉，陳金印，等. 有機(jī)酸制劑對柑桔青霉病的抑制效果[J]. 中國南方果樹，2014，43（4）：57-59，64.

[22]賈琦珍，陶大勇，王?生. 紫外分光光度法測定鹽穗木生物堿含量[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010（5）：49-52.

[23]馮?嬌，吳啟南. 不同產(chǎn)地大青葉中有機(jī)酸含量的測定[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（11）：45-46.

[24]金顯春，陶文沂. 直接降解稻草菌種篩選及降解稻草過程優(yōu)化[J]. 化學(xué)工程，2007，35（11）：37-39.

[25]殷?桃，李新社，胡墩柱，等. 多菌種混合發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)微生物油脂的研究[J]. 中國釀造，2011（6）：110-112.

[26]詹發(fā)強(qiáng)，崔衛(wèi)東，周亞飛，等. 降解棉秸稈耐熱菌株的鑒定及降解條件優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報，2012，39（1）：44-54.

[27]Li X J， Zhang Q， Zhang A L， et al. Metabolites from Aspergillus fumigatus， an endophytic fungus associated with Melia azedarach， and their antifungal， antifeedant， and toxic activities[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60（13）：3424-3431.

[28]Mellado E， Aufauvre-Brown A， Gow N A R， et al. The Aspergillus fumigatus chsC and chsG genes encode class III chitin synthases with different functions[J]. Molecular microbiology， 1996， 20（3）：667-679.

[29]Donald P. Common diseases in the home garden[J]. Lawn and Garden， 2014：1-6.

[30]湯逸飛，張國平.曲霉屬微生物資源在植物保護(hù)中應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 上海果樹科技，2017（5）：22-26.

[31]朱曉峰，段玉璽，陳立杰，等.曲霉對煙草根結(jié)線蟲的作用[J]. 農(nóng)藥，2006，45（3）：199-200， 208.

[32]曹建蘭，王曉丹，龍茜萍， 等.兩步發(fā)酵法制備固態(tài)白酒丟糟生物有機(jī)肥[J]. 釀酒科技，2014（2）：68-71.

[33]曹建蘭，王曉丹，袁?頡， 等.微生物發(fā)酵預(yù)處理固態(tài)白酒丟糟的研究[J]. 釀酒科技，2013（4）;88-91.