顧堅(jiān)未, 戴培興, 顧祖準(zhǔn)

上海交通大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心臟外科(上海 200025)

先天性心臟病是胚胎發(fā)育期間心臟及大血管形成障礙或發(fā)育異常引起的心臟解剖結(jié)構(gòu)異常。先天性心臟病發(fā)病率占出生活嬰的0.4%～1%，在小兒心血管疾病中占首位[1]。外科手術(shù)的應(yīng)用極大提高了小兒先天性心臟病的治愈率，但患兒年齡過(guò)小，身體發(fā)育不全，術(shù)后極易發(fā)生肺部感染。Th17是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的CD4+細(xì)胞的新亞群，主要分泌白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-22，在炎癥、惡性腫瘤、自身免疫性疾病中表達(dá)異常[2]。Treg細(xì)胞在維持機(jī)體免疫平衡方面發(fā)揮重要作用，主要分泌IL-10以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)肺部感染和患者外周血中 Th17/Treg 細(xì)胞失衡[4-5]，但有關(guān)先天性心臟病術(shù)后肺部感染與Th17/Treg 細(xì)胞關(guān)系研究甚少，因此本研究檢測(cè)患者外周血中Th17、Treg細(xì)胞比例以及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，以探討Th17/Treg細(xì)胞與先天性心臟病術(shù)后感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年9月至2018年6月收治的先天性心臟病行手術(shù)治療的患兒69例，其中術(shù)后發(fā)生肺部感染47例，根據(jù)肺部感染嚴(yán)重指數(shù)(PSI)[6]分為輕度感染組、重度感染組；22例沒(méi)有發(fā)生肺部感染為無(wú)感染組。3組患者性別、年齡、病情等一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。見(jiàn)表1。

表1 3組患者一般情況

納入標(biāo)準(zhǔn):診斷符合2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)粉社區(qū)肺部感染的臨床診斷依據(jù)[7]；患兒病癥為先天性心臟病術(shù)后肺部感染；患兒在進(jìn)行手術(shù)前的1個(gè)月內(nèi)，肺部沒(méi)有出現(xiàn)感染癥狀；患兒在進(jìn)行手術(shù)前的1個(gè)月內(nèi)，沒(méi)有使用過(guò)任何激素藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18歲；住院時(shí)間<5 d，包括死亡、自動(dòng)出院或轉(zhuǎn)院的患者；病歷資料不完善者；肺部腫瘤、肺水腫、肺栓塞等重癥肺部疾病。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 血標(biāo)本采集 抽取研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血4 mL×2管，置入真空采血管當(dāng)中，一管直接置于-20℃冰箱保存，另一管以 3 000 r/min 離心20 min后吸取上層清液，置于-20℃冰箱保存，現(xiàn)用現(xiàn)融，避免多次凍融。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取1.2.1全血標(biāo)本100 μL置于流式管中，無(wú)感染組樣本內(nèi)加藻紅蛋白(PE)/異硫氰酸熒光素(FITC) 標(biāo)記的鼠抗人Ig G-1抗體各 20 μL，輕度感染組和重度感染組樣本2 加PE標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人 CD25 抗體各20 μL，渦旋振蕩器混勻，于室溫下避光反應(yīng)15 min，加入溶血素1 mL，室溫避光20 min，加入PBS 緩沖液2 mL，離心，棄上清，加入1%多聚甲醛 500 μL 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè) CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比率。

1.2.3 細(xì)胞因子與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 取1.2.1中血清冰上解凍，恢復(fù)室溫后采用ELISA試劑盒檢測(cè)其中IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β水平，嚴(yán)格參照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

運(yùn)用ELISA法檢測(cè)全血標(biāo)本降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腦尿鈉肽(BNP)，試劑盒均購(gòu)自武漢明德生物科技股份有限公司。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率(ESR)以及白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)。

2 結(jié)果

2.1 3組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比較 與無(wú)感染組相比，輕度感染組CD4+Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg細(xì)胞比顯著升高(P<0.05)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例差異不顯著(P>0.05),重度感染組CD4+Th17、CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg細(xì)胞比均顯著升高(P<0.05)；與輕度感染組相比，重度感染組CD4+Th17、CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg細(xì)胞比均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比較

2.2 3組細(xì)胞因子水平比較 3組細(xì)胞因子表達(dá)水平存在差異(P<0.05)；與無(wú)感染組相比，輕度感染組和重度感染組IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β水平升高 (P<0.05)；與輕度感染組相比，重度感染組IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組相關(guān)細(xì)胞因子比較

2.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 3組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相比差異顯著(P<0.05)；與無(wú)感染組相比，輕度感染組與重度感染組CRP、PCT、ESR、WBC、BNP水平均升高(P<0.05)；與輕度感染組相比，重度感染組CRP、PCT、BNP升高(P<0.05)，而ESR、WBC差異不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)比

2.4 相關(guān)性分析 Pearson分析顯示：CD4+Th17比例與CRP、PCT、BNP呈正相關(guān)(r=0.570、0.623、0.515，P<0.05)，與ESR、WBC無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.135、0.201，P>0.05)；CD4+、CD25+Treg比例與BNP呈正相關(guān)(r=0.513，P<0.05)，與CRP、PCT呈一般正相關(guān)(r=0.315、0.360，P<0.05)，與ESR、WBC無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.153、0.105，P>0.05)；Th17/Treg比例與CRP、PCT、BNP呈顯著正相關(guān)(r=0.562、0.613、0.596，P<0.05)，與ESR、WBC無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.184、0.135，P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg及其與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

先天性心臟病是胚胎發(fā)育期間心臟及大血管形成障礙或發(fā)育異常引起的心臟解剖結(jié)構(gòu)異常。肺部感染是先天性心臟病患兒的常見(jiàn)并發(fā)癥，包括終末氣道、肺泡腔及在內(nèi)的肺實(shí)質(zhì)炎癥，主要是指下呼吸道的感染，病因以感染最為常見(jiàn)，還可由理化、免疫及藥物引起[8]。先天性心臟病患兒術(shù)后發(fā)生肺部感染原因主要為：(1)生理特征上由于長(zhǎng)時(shí)間心臟血液左向右分流，嬰幼兒先天性心臟病患者肺血流增多，肺部處于淤血狀態(tài)，不僅容易引發(fā)感染，且提供了病原菌繁殖環(huán)境加重病情；(2)手術(shù)過(guò)程屬于侵入性操作，如氣管插管、機(jī)械通氣，操作對(duì)人體防御機(jī)制產(chǎn)生影響，加大肺部感染風(fēng)險(xiǎn)；(3)嬰幼兒本身抵抗力差，也使術(shù)后肺部感染風(fēng)險(xiǎn)增高[9]。Th17及Treg均屬于T淋巴細(xì)胞亞群，相關(guān)研究表明Th17/Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在肺部感染動(dòng)物及人外周血內(nèi)都出現(xiàn)明顯異常[10-12]。但有關(guān)先天性心臟病術(shù)后肺部感染與Th17/Treg 細(xì)胞關(guān)系研究甚少，因此本研究檢測(cè)患者外周血中Th17、Treg細(xì)胞比例以及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，以探討Th17/Treg 細(xì)胞與先天性心臟病術(shù)后感染的相關(guān)性。

Th17與Treg細(xì)胞的趨化受體相同，周圍微環(huán)境是決定初始T細(xì)胞分化的重要因素。Th17細(xì)胞與促炎反應(yīng)相關(guān)，Treg細(xì)胞與抑炎反應(yīng)有關(guān)[13]。Th17是由Th0細(xì)胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的輔助性T細(xì)胞，Th17細(xì)胞主要分泌產(chǎn)生IL-17、IL-22等， 當(dāng)病原體入侵肺部嚴(yán)重感染時(shí)，IL-17、IL-22等細(xì)胞因子雖不能直接清除或殺傷病原體，而是分別作用于肺上皮細(xì)胞相應(yīng)受體，促進(jìn)肺上皮防御素的生成直接破壞病原體結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抗感染的作用。在肺部感染過(guò)程中，IL-17能夠可以募集活化中性粒細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，IL-22能增強(qiáng)損傷的支氣管上皮細(xì)胞修復(fù)，促進(jìn)其細(xì)胞再生，提高支氣管黏膜抗損傷能力，通過(guò)維持肺黏膜屏障的完整從而有效限制了肺部病原體的擴(kuò)散[14]。

Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，在免疫調(diào)節(jié)中通過(guò)下調(diào)免疫反應(yīng)降低病原體對(duì)機(jī)體的過(guò)度破壞，也可分泌IL-10抑制T細(xì)胞的活性來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。正常生理狀態(tài)下，Th17和Treg細(xì)胞在體內(nèi)處于平衡狀態(tài)，共同維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)。肺部感染嚴(yán)重時(shí)，出現(xiàn)細(xì)菌或病毒侵入時(shí)IL-17、IL-22等促炎因子過(guò)度表達(dá)影響初始T細(xì)胞的分化情況，出現(xiàn)Th17優(yōu)勢(shì)，在TGF-β共同作用抑制 Treg細(xì)胞分化，打破Th17/Treg平衡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重造成組織損傷[15]。Paats等[16]研究表明，社區(qū)獲得性肺炎(CAP)患者外周血及肺泡灌洗液中Th17細(xì)胞比例高于體檢健康者，Th17細(xì)胞參與了社區(qū)獲得性肺炎患者肺部炎癥反應(yīng)。本研究中術(shù)后肺部感染患兒CD4+Th17細(xì)胞比例顯著升高，且隨著肺部感染的加劇而升高，與相關(guān)研究一致。術(shù)后肺部感染患兒外周血內(nèi)IL-17、IL-22水平顯著高于無(wú)肺部感染者，且隨感染加重而增高，提示IL-17、IL-22參與肺部炎癥反應(yīng)。

本研究中CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、IL-10和TGF-β在肺部感染患者外周血中升高，但升高速度低于Th17以及IL-17、IL-22，因此Th17/Treg比例呈升高趨勢(shì)，重度感染組中Th17/Treg明顯高于輕度感染組，差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明Th17/Treg細(xì)胞失衡以及相關(guān)細(xì)胞因子異常表達(dá)與肺部感染密切相關(guān)，患者機(jī)體其處于免疫調(diào)節(jié)紊亂與炎性反應(yīng)狀態(tài)，可作為判斷疾病嚴(yán)重程度與預(yù)后的有效治療。因此可以通過(guò)控制細(xì)胞分化環(huán)境，抑制 Th17細(xì)胞分化，增強(qiáng) Treg活性，調(diào)節(jié) Th17/Treg平衡，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，降低機(jī)體損傷[17]。

CRP、PCT是感染常見(jiàn)指標(biāo)，感染程度越重含量越高[18]。本研究中，肺部感染者CRP、PCT、BNP水平顯著高于無(wú)肺部感染者，且隨病情增重水平升高，表明此三項(xiàng)指標(biāo)可較好反映肺部感染程度。而ESR、WBC計(jì)數(shù)水平在各組間差別不明顯，原因可能為ESR、WBC計(jì)數(shù)受其他多因素影響，對(duì)判斷肺部感染價(jià)值較小[19]。Pearson分析顯示，Th17、Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg比例與CRP、PCT、BNP呈正相關(guān)，而與ESR、WBC計(jì)數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性。進(jìn)一步證明Th17/Treg與肺部感染密切相關(guān)，臨床中聯(lián)合檢測(cè)外周血CRP和PCT水平，對(duì)病情觀察和療效判斷上具有重要價(jià)值。

綜上所述，Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)異常、Th17/Treg失衡可能是先天性心臟病患者術(shù)后肺部感染的重要原因。由于樣本數(shù)較少，有關(guān)機(jī)制研究有待進(jìn)一步研究。