李滿群, 許清河

1湖州市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科(浙江湖州 313000)； 2湖州市中心醫(yī)院藥劑科(浙江湖州 313000)

過敏性鼻炎是機體接觸變應(yīng)原后，主要由IgE介導的鼻黏膜非感染性炎性疾病，屬于速發(fā)型(1型)變態(tài)反應(yīng)，其病理可能是機體受到變應(yīng)原刺激后多種免疫活性細胞參與的疾病過程[1]，常反復發(fā)作影響患兒的日常及學習生活。Chia等[2]認為白細胞介素-33(interleukin 33，IL-33)通過活化巨噬細胞可能導致過敏性哮喘加重時氣道炎癥加劇。近幾年來關(guān)于微小RNA的報道日漸增多，其中有研究認為微小RNA-487b(mircoRNA-487b，miR-487b)可以負向調(diào)控IL-33/ST2信號通路，誘導腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)表達降低，減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)[3]。也有研究顯示miR-487b通過控制IL-33轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的水平來微調(diào)這些細胞的固有免疫宿主防御和促炎反應(yīng)，從而在巨噬細胞中發(fā)揮負調(diào)控作用[4]。因此，本研究從炎癥角度入手針對miR-487b、IL-33在過敏性鼻炎患兒血漿中的表達水平，探討其臨床意義以期對未來的臨床工作提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年8月于本院耳鼻喉門診確診并治療的過敏性鼻炎患兒共110例作為觀察組，其中男57例，女53例，年齡(7.20±2.61)歲。

納入標準：過敏性鼻炎患兒診斷標準參照2009年中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會和中華醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會鼻科學組制訂的《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》[5]。

排除標準：(1)近期使用過抗過敏藥物、抗組胺藥、激素等治療的過敏性鼻炎患兒；(2)合并過敏性哮喘、哮喘等肺部疾病患兒；(3)有鼻腔手術(shù)史者；(4)嚴重心、肝、腎疾病患兒；(5)腦部器質(zhì)性病變或癲癇患兒。

同期選取于本院體檢結(jié)果為健康者120例作為對照組，其中男58例，女62例，年齡(6.97±1.08)歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

本研究中所有患者均由主治以上醫(yī)師明確診斷，本試驗經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有受試對象均由專業(yè)人員詳細告知研究內(nèi)容并自愿參加，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：DEM201-20T)購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(貨號：RR037A)及TRIzol試劑(貨號：JMS12279)均購自日本TaKaRa公司；臺式高速冷凍離心機(MiniSpin)購自德國Eppendorf公司；恒溫恒濕箱(LHS-250HCN)購自上海軒儀儀器設(shè)備有限公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：MiniAmp)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Human IL-33 ELISA kit(JK-A-1494)、TNF-α ELISA kit(JK-A-0016)、CRP ELISA kit(JK-A-5084)均購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集與處理 兩組受試者均于門診檢查時取肘靜脈血3 mL，肝素抗凝，3 500 r/min離心10 min，收集上清液后注入EP管，-20℃低溫冰箱保存待測定。

1.3.2 實時熒光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)測定過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b的表達水平 從-80℃取出血漿樣本，恢復室溫后按試劑盒說明書提取血漿總RNA，異丙醇沉淀濃縮后，用75%酒精洗滌，干燥后加入100 μL DEPC水，檢測所得RNA純度及完整度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系20 μL)：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA(50 ng/μL)模板2 μL，上下游引物各1 μL，水6 μL，每個樣本設(shè)置3個平行。上下游引物、內(nèi)參基因由上海恒斐生物科技有限公司設(shè)計并合成，miR-487b以U6為內(nèi)參，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預變性8 min；90℃變性20 s、60℃退火40 s，72℃延伸25 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)72℃收集熒光。采用2-ΔΔCt法計算血漿中miR-487b相對表達量。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法測定兩組受試者血漿中IL-33以及炎癥相關(guān)指標TNF-α、CRP的表達水平 采用ELISA法檢測兩組受試者血漿中IL-33、TNF-α、CRP的表達水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

表1 qRT-PCR引物序列

血漿中miR-487b、IL-33表達的相關(guān)性；繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b、IL-33表達對過敏性鼻炎發(fā)病的預測價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 兩組受試者年齡、性別、身高、BMI差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，家族史比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組一般臨床特征資料比較

2.2 兩組受試者血漿中miR-487b、IL-33表達水平的比較 觀察組患兒血漿中miR-487b表達水平顯著低于對照組，IL-33、TNF-α、CRP表達高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組受試者血漿中miR-487b、IL-33表達水平的比較

2.3 過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b、IL-33、TNF-α、CRP表達水平的相關(guān)性 過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b與TNF-α、CRP表達均呈負相關(guān)(r=-0.531、-0.455，P<0.05)，IL-33與TNF-α、CRP均呈正相關(guān)(r=0.620、0.587，P<0.05)，miR-487b、IL-33表達呈負相關(guān)(r=-0.641，P=0.000)。見表4。

表4 過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b、IL-33與TNF-α、CRP表達水平的相關(guān)性

2.4 過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b、IL-33表達水平對過敏性鼻炎發(fā)病的預測價值 ROC曲線顯示，血漿中miR-487b預測過敏性鼻炎發(fā)生的ROC曲線下面積為0.837(95%CI：0.784～0.891)，截斷值為0.965，敏感度為92.7%，特異度為65.8%；血漿中IL-33預測過敏性鼻炎發(fā)生的ROC曲線下面積為0.898(95%CI：0.855～0.940)，截斷值為67.001 ng/L，敏感度為77.3%，特異度為89.2%。見圖1。

3 討論

過敏性鼻炎是一種常見而難治的非感染性鼻黏膜炎性疾病，主要由體內(nèi)過敏原暴露后IgE介導，其發(fā)病機制可能與炎癥反應(yīng)和機體免疫功能有關(guān)[6]。目前公認的機制為抗原進入致敏個體內(nèi)引起相關(guān)炎癥介質(zhì)釋放和炎癥細胞聚集，大多數(shù)抗原為吸入性抗原，以塵螨和花粉最常見,越來越多的研究強調(diào)疾病個體的免疫系統(tǒng)的整體性[7]。兒童過敏性鼻炎的典型癥狀包括噴嚏、清水樣涕、鼻癢和鼻塞，典型體征為雙側(cè)鼻黏膜蒼白、水腫、鼻腔有水樣分泌物，眼部主要為結(jié)膜充血、水腫[8]。胡曉春等[9]認為過敏性鼻炎發(fā)病的獨立危險因素為頻繁呼吸道感染、吸煙、過敏史(藥物、花粉等)、家族鼻炎史。由于患兒不會主訴癥狀，癥狀常不典型且易與感冒相混淆，使得兒童過敏性鼻炎難以被及時發(fā)現(xiàn)，因此相關(guān)指標的檢測顯得尤為重要。本研究結(jié)果中過敏性鼻炎患兒血漿中TNF-α、CRP表達均高于對照組，提示此時過敏性鼻炎患兒正經(jīng)歷某種程度的炎性反應(yīng)過程，猜測可能是由于個體免疫在接觸過敏原時調(diào)動炎性細胞因子分泌。

圖1 過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b、IL-33水平對發(fā)病的預測價值

IL-33是一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子，IL-33通過與ST2結(jié)合直接或間接地介導過敏性鼻炎發(fā)病的各種細胞活化，促進Th2型炎性細胞因子的釋放[10]。IL-33在變應(yīng)性鼻炎機制發(fā)生時與多種炎性細胞構(gòu)成復雜的網(wǎng)絡(luò)相互作用，導致IgE產(chǎn)生、黏液分泌增加及組織嗜酸性粒細胞浸潤，共同促進變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生與發(fā)展[11]。胡琛等[12]學者發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎患者相比于健康人群血清中TNF-α、IL-33、TLR4和NF-κB呈高表達狀態(tài)，且糖皮質(zhì)激素治療后過敏性鼻炎患者血清內(nèi)TNF-α、IL-33、TLR4和NF-κB的表達顯著降低。本研究結(jié)果中，過敏性鼻炎患兒血漿中IL-33表達水平高于對照組，提示IL-33在過敏性鼻炎進程中起到一定作用，或存在某種參與機制，猜測IL-33可促進過敏性鼻炎各種炎性細胞因子釋放，導致IgE分泌從而引起患兒過敏性鼻炎速發(fā)，或可通過TLR4/NF-κB通路，尚處于炎癥反應(yīng)過程中，出現(xiàn)刺激氣道黏膜、鼻黏膜等情況，患兒出現(xiàn)流涕、噴嚏等典型癥狀。

miR-487b在多種疾病機制中都有所表達。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)miR-487b可通過抑制IL-33/ST2信號通路抑制IL-33，從而減少慢性心力衰竭中的炎癥反應(yīng)、延緩心肌纖維化。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)IL-33可能是miR-487b的直接靶標，變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜組織中IL-33及其特異性配體ST2水平升高，而miR-487b表達水平明顯降低；過敏性鼻炎模型小鼠miR-487b上調(diào)可以抑制IL-33和ST2表達，從而導致IL-33和ST2表達降低，miR-487b在變應(yīng)性鼻炎中起到抑制作用，miR-487b/IL-33-ST2軸可能是治療變應(yīng)性鼻炎的潛在治療靶標。本研究結(jié)果中，miR-487b在過敏性鼻炎患兒血漿中呈低表達，提示miR-487b參與過敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展過程，猜測miR-487b在過敏性鼻炎發(fā)生過程中或起到抑制炎癥反應(yīng)的作用，其上調(diào)可抑制IL-33及其配體ST2表達，miR-487b可能是過敏性鼻炎的相關(guān)有效檢測指標。

本研究結(jié)果顯示miR-487b與IL-33表達呈負相關(guān)，這與研究文獻所得出的結(jié)果基本一致，可能存在miR-487b/IL-33-ST2軸以調(diào)節(jié)過敏性鼻炎發(fā)生過程中相關(guān)因子釋放，但相關(guān)因子具體表達如何仍需進一步研究。而miR-487b表達與TNF-α、CRP表達呈負相關(guān)，猜測miR-487b可起到抑制過敏性鼻炎所引起的相關(guān)炎性反應(yīng)，同時IL-33與TNF-α、CRP表達呈正相關(guān)，猜測IL-33與TNF-α、CRP可能共存于某種由機體免疫調(diào)動的炎性反應(yīng)機制之中。另經(jīng)ROC曲線提示當檢測miR-487b表達水平低于0.965、IL-33表達水平高于67.001 ng/L時患兒可能速發(fā)過敏性鼻炎，家屬應(yīng)密切觀察，早確診早治療，以減緩患兒病情的嚴重程度，但由于過敏性鼻炎多速發(fā)難治，miR-487b與IL-33可作為輔助檢測指標。

綜上所述，過敏性鼻炎患兒血漿中miR-487b呈低表達、IL-33呈高表達，兩者具有一定負相關(guān)，可能是預測過敏性鼻炎發(fā)病的良好輔助指標。但本研究仍存在一些問題，如過敏性患兒樣本數(shù)較少、尚未研究IL-33配體ST2的表達情況，未來可針對這兩個問題進行補充研究。