許元峰 胡 煒

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 中國科學院種子創(chuàng)新研究院, 武漢 430072;2. 中國科學院大學, 北京 100049)

魚類的肉質(zhì)是一個復雜的性狀, 受諸多因素的影響。評價魚類肉質(zhì)性狀的指標主要有肌肉的組織學特征、魚肉的組成成分以及生長代謝相關基因的表達特征等[1—3]。Rivero等[4]發(fā)現(xiàn), 魚肉的嫩度與肌纖維直徑呈負相關, 而與肌纖維密度呈正相關, 即魚類肌肉肌纖維越細且肌纖維密度越大, 魚肉越細嫩。有報道表明, 魚類脂肪含量越高, 多汁口感越強烈,風味也更佳[5]。魚肉中的谷氨酸等呈味氨基酸、肌肽等小分子肽類、一磷酸肌苷等核苷酸衍生物可協(xié)同作用, 形成魚肉的鮮味[6]。魚類肌纖維的生長受到肌源性調(diào)節(jié)基因(Muscle regulatory factors,MRFs)家族的調(diào)控, 包括myod、mrf5、myog和mrf4等基因,MRFs的表達變化會改變肌肉的肉質(zhì)特征[7]。

大鱗副泥鰍(P. dabryanus)、泥鰍(M. anguillicaudatus)和北方泥鰍(M. bipartitus)屬均屬于鰍科(Cobitidae)、花鰍亞科(Cobitinae)魚類。其中大鱗副泥鰍和泥鰍是我國重要的養(yǎng)殖魚類。大鱗副泥鰍和泥鰍的肉質(zhì)研究有少量報道, 主要針對魚肉營養(yǎng)成分的比較, 發(fā)現(xiàn)泥鰍的必需氨基酸含量、不飽和脂肪酸含量高于大鱗副泥鰍, 認為泥鰍的營養(yǎng)價值更高[8—12],這三種鰍較為全面的肉質(zhì)比較研究報道尚未見報道。

本研究采用組織切片、生化組分分析以及實時熒光定量PCR等方法, 對大鱗副泥鰍、泥鰍和北方泥鰍的肌肉組織學特征、肌肉營養(yǎng)成分以及肌肉生長與脂肪代謝相關基因表達特征進行了比較分析, 以期為大鱗副泥鰍和泥鰍的遺傳改良提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

大鱗副泥鰍和北方泥鰍于2018年9月采購自湖北省武漢市小東門綜合市場, 泥鰍購自湖南省懷化市蔬菜公司蔬菜果品批發(fā)市場。參考《中國淡水魚類檢索》及大鱗副泥鰍和泥鰍線粒體特異性線粒體片段標記和微衛(wèi)星標記, 對這三種花鰍亞科魚類進行了種鑒別[13,14]。

1.2 樣品采集

挑選外觀健康、無病害癥狀的1—2年齡大鱗副泥鰍、2年齡及以上泥鰍和2年齡及以上北方泥鰍各30尾(其中雌雄各15尾)。大鱗副泥鰍體重(14.36±2.50) g, 體長(11.7±0.5) cm; 泥鰍體重(9.38±1.50) g, 體長(10.5±0.5) cm; 北方泥鰍體重(9.85±1.50) g, 體長(12.3±0.5) cm。

實驗魚置于水族箱禁食24h后, 放入質(zhì)量濃度為180 mg/L的MS-222麻醉溶液中麻醉, 除去泥鰍皮取樣。取背部及腹部肌肉共約0.5 g, 用于生化組分測定和RNA提取, 每種鰍取30個樣品, 每10個樣品混為一個樣, 共三個平行重復。取背鰭部位軀干進行截取, 置于波恩氏液中固定24h, 隨后轉(zhuǎn)入75%酒精溶液中保存, 用于肌肉組織的石蠟切片, 每種鰍取30個樣品。取背鰭部位軀干進行截取, 置于4%PFA/PBS溶液中4℃固定過夜, 經(jīng)PBS漂洗后置于30%的蔗糖/PBS溶液中4℃脫水保存, 用于肌肉組織的冷凍切片, 每種鰍取3個樣品。

1.3 肌肉組織切片

肌肉組織的石蠟切片、蘇木精和伊紅溶液染色以及肌肉組織的冷凍切片方法參照Xia等[15]方法。冷凍切片用0.5%油紅O/(60%異丙醇+40%水)溶液染色, 使用明膠甘油封片。每種鰍制成石蠟切片15張, 冷凍切片3張。切片于顯微鏡下(BX-53多光譜顯微成像系統(tǒng), Olympus)觀察, 選取肌纖維完整, 邊際清晰的切片區(qū)域進行拍照。采用ImageJ軟件對圖片進行處理, 并測量肌纖維橫截面積、周長和直徑; 肌纖維密度用視場內(nèi)肌纖維根數(shù)(剔除與視場右下兩邊有接觸的個數(shù))比上視場面積所得。

1.4 生化組分分析

每種鰍取3個混樣, 進行生化組分分析。采用凱氏定氮法(GB5009.5-2016)檢測樣品中粗蛋白含量;采用酸水解法(GB5009.6-2016)檢測樣品中粗脂肪含量; 采用干燥恒重法(105±5)℃(GB/T 10362-2008)檢測樣品中水分含量; 采用馬弗爐灼燒法(GB5009.4-2016)檢測樣品中灰分含量; 采用酸水解法獲得樣品中的氨基酸, 液相色譜儀(UItiMate 3000 UHPLC色譜儀, Thermo)檢測, 根據(jù)標準品出峰時間對樣品所出峰進行定性, 采用外標法進行定量, 最終測得樣品中各氨基酸的含量; 采用氣相色譜(CPSIL88色譜柱, Agilent)與質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS法)檢測樣品中常見的37種脂肪酸酸含量, 樣品經(jīng)脂化、濃縮后進入GC-MS系統(tǒng), 離子碎片進行自動識別和積分, 按峰面積歸一化法計算樣品中各脂肪酸的含量。

1.5 必需氨基酸評價

換算必需氨基酸每克氮含氨基酸的毫克數(shù)mg/g(N), 具體計算方法為將已測得的必需氨基酸的干重含量(%)除以16[16], 并將換算后的含量與雞蛋中對應的必需氨基酸含量以及WHO/FAO于1973年提出的必需氨基酸含量進行比較[17,18]。然后根據(jù)孫海坤等[19]方法計算必需氨基酸指數(shù)(Essential amino acid index, EAAI)。

1.6 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR參照Xia等[15]方法, 每種鰍取3個混樣, 每個樣重復3次, 實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)利用2–ΔΔCt法進行分析, 引物詳情見表 1, 所用退火溫度均為55℃。myod等肌肉生長相關基因表達水平分析時, 設大鱗副泥鰍相應基因mRNAs的表達量為對照, 其值均設為1倍;elovl5等脂肪代謝相關基因表達水平分析時, 設北方泥鰍相應基因mRNAs的表達量為對照, 其值均設為1倍。

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析

使用Excel2010和SPSS22.0軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計, 含有多重復的數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤的形式表示。實驗數(shù)據(jù)通過單因素方差分析(One-way ANOVA), 然后進行 Duncan’s多重比較,當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果

2.1 肌肉組織學特征

研究了三種鰍的肌肉組織學特征, 檢測了肌纖維的橫截面積、周長、直徑以及密度, 并且觀察了三種鰍肌肉中脂肪的分布情況。發(fā)現(xiàn)肌肉橫截面積、周長和直徑三項指標均是大鱗副泥鰍、泥鰍和北方泥鰍依次降低, 肌纖維密度則是大鱗副泥鰍、泥鰍和北方泥鰍依次升高(表 2)。大鱗副泥鰍肌纖維橫截面積分別是泥鰍和北方泥鰍的1.28倍和1.43倍, 肌纖維密度分別是泥鰍和北方泥鰍的0.87倍和0.74倍。由此可見北方泥鰍的肌纖維最為纖細、密度最大, 泥鰍次之, 大鱗副泥鰍則是最為粗壯、密度最小(圖 1)。在三種鰍中, 脂肪主要沉積于下皮組織、肌隔及腹腔內(nèi)側。其中大鱗副泥鰍背部區(qū)域肌隔中脂肪的沉積量最多, 泥鰍次之, 北方泥鰍最少; 北方泥鰍腹腔內(nèi)側有大量的脂肪沉積, 而泥鰍很少(圖 2)。

2.2 肌肉營養(yǎng)成分

肌肉的基本組成成分 如表 3所示, 北方泥鰍的水分含量顯著高于大鱗副泥鰍和泥鰍, 而大鱗副泥鰍和泥鰍的水分含量差異不顯著。三種鰍的灰分含量未有顯著性差異。三種鰍的粗蛋白和粗脂肪含量均存在顯著性差異, 且均是大鱗副泥鰍含量高于泥鰍, 泥鰍高于北方泥鰍。

表 1 實時熒光定量PCR所用引物信息Tab. 1 Primers used for fluorescent quantitative real-time PCR

表 2 三種鰍肌纖維品質(zhì)Tab. 2 Comparison on the fiber of three Cobitidaes

肌肉的氨基酸組成成分如表 4所示, 泥鰍必需氨基酸含量達(33.21±1.60)%, 顯著高于大鱗副泥鰍(28.31±1.85)%和北方泥鰍(28.09±1.04)%, 大鱗副泥鰍和北方泥鰍間差異不顯著。四種呈味氨基酸總含量為泥鰍最高, 大鱗副泥鰍次之, 北方泥鰍最低。

必需氨基酸營養(yǎng)價值將表 4中三種鰍肌肉中各必需氨基酸含量換算成每克氮所含氨基酸的毫克數(shù), 將其與雞蛋蛋白以及WHO/FAO 標準中的必需氨基酸含量進行比較。三種鰍必需氨基酸含量占氨基酸總量比值均達到WHO/FAO標準, 并接近雞蛋蛋白中的比值, 三種鰍EAAI分別為: 泥鰍74.38, 大鱗副泥鰍65.11, 北方泥鰍60.14。

圖 1 三種鰍肌纖維橫切面Fig. 1 The cross section of these three Cobitidaes’ muscle fiber

肌肉的脂肪酸組成成分如表 5所示, 三種鰍總多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)含量無顯著性差異, 但是大鱗副泥鰍除亞油酸以外的PUFA含量僅有(7.86±0.24)%, 顯著低于泥鰍(24.18±1.99)%和北方泥鰍(24.43±0.26)%。大鱗副泥鰍總ω-3不飽和脂肪酸含量顯著低于泥鰍和北方泥鰍, 但是其總ω-6不飽和脂肪酸顯著高于泥鰍和北方泥鰍。泥鰍和北方泥鰍除少數(shù)飽和脂肪酸外, 含量無顯著性差異。

2.3 肌肉生長、脂質(zhì)代謝相關基因的表達

檢測了myod、myog、mrf4和mstn四個肌肉生長相關基因在三種鰍肌肉中的表達差異(圖 3), 大鱗副泥鰍myod、myog和mstn基因的相對表達量在三種鰍中最高, 而mrf4基因的相對表達量最低; 泥鰍mrf4基因的相對表達量在三種鰍中最高,myod和mstn基因的相對表達量介于大鱗副泥鰍和北方泥鰍之間,myog基因的相對表達量最低; 北方泥鰍myog和mrf4基因的相對表達量介于大鱗副泥鰍和北方泥鰍之間,myod和mstn基因的相對表達量三種鰍中最低。

檢測了elovl5等8個脂質(zhì)代謝相關基因的表達特征(圖 4), 大鱗副泥鰍elovl5、fads2、scd、ucp2和lpl五個基因的相對表達量在三種鰍中最高,pparg基因的相對表達量介于泥鰍和北方泥鰍之間,fas和srebp1基因的相對表達量最低; 泥鰍srebp1基因的相對表達量在三種鰍中最高,fas基因的相對表達量介于大鱗副泥鰍和北方泥鰍之間,elovl5、fads2、scd、lpl和pparg五個基因的相對表達量最低; 北方泥鰍fas和pparg基因的相對表達量在三種鰍中最高,elovl5、fads2、scd、和srebp1五個基因的相對表達量介于大鱗副泥鰍和泥鰍之間; 泥鰍和北方泥鰍ucp2基因的相對表達量差異不顯著。

3 討論

3.1 三種鰍的肉質(zhì)特點

魚肉的嫩度一直是養(yǎng)殖魚類品質(zhì)性狀重要的口感指標之一。魚類肌肉的嫩度與肌肉組織中肌纖維的特征密切相關, 一般認為肌纖維直徑越小而肌纖維密度越大, 魚肉的細嫩度越佳, 口感越好[6]。按照上述標準, 北方泥鰍肉質(zhì)最為細嫩, 泥鰍次之,大鱗副泥鰍肉質(zhì)相對粗糙。

油潤多汁也是評價魚肉肉質(zhì)的一項重要指標,肉類多汁的口感與肌肉中粗脂肪的含量呈現(xiàn)正相關[20], 大鱗副泥鰍的粗脂肪含量最高, 而且大鱗副泥鰍脂肪在背部、皮下組織以及腹腔內(nèi)側分布廣泛,因此在三種鰍中, 大鱗副泥鰍的肉質(zhì)最為油潤多汁。

魚肉的鮮味是不同于其他肉類的一項重要口感指標, 也是影響魚肉價格的關鍵因素之一。呈味氨基酸的組成以及含量, 特別是呈鮮味的谷氨酸和天冬氨酸含量是影響魚肉鮮味的重要因素[18]。比較三種鰍的總呈味氨基酸含量以及谷氨酸和天冬氨酸含量, 認為泥鰍肉質(zhì)最為鮮美, 大鱗副泥鰍次之, 北方泥鰍鮮味程度較差。

3.2 三種鰍的營養(yǎng)價值特點

圖 2 三種鰍肌肉中脂肪分布Fig. 2 Lipid distribution in muscle of three Cobitidaes

表 3 三種鰍肌肉的基本營養(yǎng)成分Tab. 3 Basic muscle nutrient components of three Cobitidaes muscle (%; n=3)

表 4 三種鰍肌肉中氨基酸組成Tab. 4 Muscle amino acid composition of three Cobitidaes (%;n=3)

魚肉的營養(yǎng)價值主要決定于各種營養(yǎng)物質(zhì)的含量和組成成分。必需氨基酸是人體內(nèi)無法合成或者合成量較少無法滿足人體新陳代謝需要的一類氨基酸, 必需氨基酸攝入不足會造成機體代謝紊亂、抵抗能力降低等問題[21]。通過計算肉類的EAAI可以客觀地反映肉類中必需氨基酸的營養(yǎng)價值。脂肪酸根據(jù)飽和程度可分為飽和脂肪酸(Saturated fatty acid, SFA)、單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid, MUFA)及多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid, PUFA)三類[22]。PUFA根據(jù)雙鍵出現(xiàn)的位置分為ω-6不飽和脂肪酸和ω-3不飽和脂肪酸, 兩者的比例影響PUFA降血脂功能, 目前普遍認為SFA含量低, PUFA含量特別是ω-3不飽和脂肪酸高的脂肪酸攝入結構更為健康。此外, 花生四烯酸、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)對于幼兒發(fā)育、抗癌及預防心血管疾病有特殊作用, 三者的含量也在一定程度上反映了魚肉的營養(yǎng)價值[23]。

表 5 三種鰍肌肉中脂肪酸組成Tab. 5 Muscle fatty acid composition of three Cobitidaes (%,n=3)

圖 3 三種鰍肌肉組織中肌肉生長相關基因相對表達量的比較(同一組上標不同表示差異顯著, P<0.05)Fig. 3 The relative expression levels of muscle growth-related genes in three Cobitidaes’ muscular tissue (the different superscripts represents significant difference in the same group, P<0.05)

圖 4 三種鰍肌肉組織中脂肪代謝相關基因相對表達量的比較(同一組上標不同表示差異顯著, P<0.05)Fig. 4 The relative expression levels of lipid metabolism-related genes in three Cobitidaes’ muscular tissue (the different superscripts represents significant difference in the same group, P<0.05)

三種鰍均有必需氨基酸含量高以及PUFA含量高的特點。在三種鰍必需氨基酸評價比較中, 泥鰍、大鱗副泥鰍和北方泥鰍的EAAI依次降低。三種鰍總PUFA含量無顯著性差異, 但是在除去亞油酸的總PUFA含量比較中, 大鱗副泥鰍遠低于泥鰍和北方泥鰍, 大鱗副泥鰍中各PUFA的含量不如泥鰍和北方泥鰍均衡。此外, 大鱗副泥鰍ω-3不飽和脂肪酸含量僅為泥鰍的52.83%和北方泥鰍的53.75%,花生四烯酸、EPA和DHA的含量均低于泥鰍和北方泥鰍。綜上, 在氨基酸方面的營養(yǎng)價值, 泥鰍要高于大鱗副泥鰍, 大鱗副泥鰍高于北方泥鰍; 在脂肪酸方面的營養(yǎng)價值, 泥鰍和北方泥鰍差異不明顯,而大鱗副泥鰍低于泥鰍和北方泥鰍。

3.3 三種鰍肌肉生長與脂質(zhì)代謝相關基因表達特點

動物肌肉生長受myod、myog、mrf4和mstn等基因調(diào)控。myod基因是肌細胞生成的決定基因,myog和mrf4則是在肌細胞的分化過程中發(fā)揮功能。在肌肉生長過程中,myod最先表達, 隨后誘導myog表達, 而mrf4作為終端誘導因子基因最后表達[24—28]。mstn是肌肉生長過程中的負調(diào)控基因, 抑制肌肉的過快生長[29]。

大鱗副泥鰍的肌纖維橫截面積最大、粗蛋白含量最高, 表明大鱗副泥鰍肌肉比泥鰍和北方泥鰍發(fā)達; 此外, 大鱗副泥鰍myod的相對表達量較高,mrf4的相對表達量較低, 且大鱗副泥鰍mstn的相對表達量較高, 提示大鱗副泥鰍的肌細胞處于肌肉生長過程的早期階段, 而且肌肉有進一步生長的潛力。北方泥鰍肌肉生長相關基因的表達特點與大鱗副泥鰍相反,myod的相對表達量較低,mrf4的相對表達量較高,mstn的相對表達量很低; 而且北方泥鰍肌纖維橫截面積最小、粗蛋白含量低, 提示北方泥鰍更多的肌細胞處于肌肉生長過程的后期階段, 肌肉不如大鱗副泥鰍和泥鰍發(fā)達。泥鰍的肌肉生長情況則處于大鱗副泥鰍和北方泥鰍之間。

elovl5、lpl、fas、pparg和srebp1為調(diào)節(jié)脂肪形成的基因, 其編碼的酶通過催化延長脂肪酸鏈、水解甘油三脂釋放游離脂肪酸、合成脂肪酸、合成三酰甘油等方式促進脂肪的形成[30—35]。ucp2為調(diào)節(jié)脂肪分解的基因, 其編碼的酶可增加三羧酸循環(huán)的活性和脂肪酸的氧化, 促進脂肪分解[36]。fads2和scd為調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸形成的基因, 相應的酶催化脂肪酸不飽和鍵的形成[33]。

大鱗副泥鰍粗脂肪含量和總不飽和脂肪酸含量最高; 同時大鱗副泥鰍elovl5、lpl、ucp2、fads2和scd五個基因在三種鰍中表達量最高, 提示在三種鰍中, 大鱗副泥鰍的脂肪代謝活動最為活躍。北方泥鰍elovl5、lpl、fas、pparg、fads2和scd六個基因的表達量均顯著高于泥鰍,ucp2的表達量兩者間無顯著性差異; 而且北方泥鰍腹腔內(nèi)側的內(nèi)臟脂肪沉積量根據(jù)組織學切片分析遠高于泥鰍, 提示北方泥鰍脂肪形成能力、不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化能力和內(nèi)臟脂肪沉積能力強于泥鰍, 北方泥鰍的脂肪代謝活動相較于泥鰍更為活躍。但在肌肉生化組分檢測中, 泥鰍粗脂肪含量高于北方泥鰍, 可能的原因是在以肌肉作為樣品檢測粗脂肪含量時, 內(nèi)臟脂肪大部分并未被檢測所致。

4 結論

綜上所述, 三種鰍肉質(zhì)各有特點。大鱗副泥鰍蛋白質(zhì)含量高、油潤多汁, 但是肉質(zhì)相對粗糙、營養(yǎng)價值較差; 泥鰍營養(yǎng)價值極高且肉質(zhì)鮮美; 北方泥鰍肉質(zhì)細嫩, 脂肪酸組成方面的營養(yǎng)價值高, 但是肉質(zhì)的鮮美程度較差。三種鰍的肌肉生長活動和脂肪代謝活動存在差異, 可能是上述三種鰍肉質(zhì)各具特點的原因之一。進一步解析上述三種鰍的肉質(zhì)形成的分子遺傳基礎, 對于鰍科魚類新品種研制具有重要的意義。