王菲，李穎，簡(jiǎn)天琪，張琪，王戰(zhàn)勇

(遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001)

黑苦蕎俗稱苦蕎，學(xué)名鞭撻蕎麥，屬雙子葉蓼科蕎麥屬植物，是蕎麥屬中的一種[1-2]。黃酮具有抗氧化、美容、保肝護(hù)肝、防癌、抑菌、增免等活性，可作為藥物用于臨床治療[3-7]。故提取黑苦蕎麥黃酮并研究其生物活性，有利于黑苦蕎麥黃酮綜合利用，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本文采用超聲輔助溶劑浸提法對(duì)黑苦蕎麥黃酮進(jìn)行提取，利用響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮提取條件。研究黑苦蕎麥黃酮的體外抗氧化活性，為其綜合利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

黑苦蕎麥，購(gòu)自滇之味養(yǎng)生堂；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH均為色譜純；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、抗壞血酸、三羥基氨基甲烷、鄰苯三酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、三羥基氨基甲烷、硫代巴比妥酸、鐵氰化鉀、無(wú)水乙醇、鹽酸、水楊酸、過(guò)氧化氫、三氯乙酸均為分析純；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

ALC-1100.2電子天平；Q-250B型多功能高速粉碎機(jī)；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋；TDL-80-2B臺(tái)式離心機(jī)；UV-2800可見(jiàn)分光光度計(jì)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)。

1.2 黑苦蕎黃酮提取

黑苦蕎麥烘干，粉碎，過(guò)40目篩，黑苦蕎麥粉末0.50 g，按一定液料比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定超聲功率下處理一定時(shí)間，接下來(lái)在一定水浴溫度下浸提一定時(shí)間，取出后離心，取上清液。

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測(cè)定黃酮含量[8-9]，吸光度與黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.393 0x-0.007 4，R2=0.999 3。得率公式如下：

式中X——從方程中算得的提取液中黃酮質(zhì)量，mg；

M——樣品質(zhì)量，g。

1.3 黑苦蕎黃酮體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.1 對(duì)DPPH的清除效果[10-11]量取9份 0.2 mmol/L DPPH 2 mL，倒入不同濃度樣液1 mL，補(bǔ)充95%乙醇到4 mL，混合均勻，靜置30 min。以水為參比，在517 nm處測(cè)樣品AS，用VC作陽(yáng)性對(duì)照。用95%乙醇作空白，測(cè)AC，按下面公式計(jì)算清除率。

清除率=(AC-AS)/AC×100%

式中AC——空白吸光度測(cè)定值；

AS——樣品吸光度測(cè)定值。

1.3.2 對(duì)·O2-的清除效果 根據(jù)文獻(xiàn)[11-13]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用水為參比，在320 nm處測(cè)樣品AS，做3個(gè)平行。以1 mL重蒸水替代樣品做空白，測(cè)AC，用VC為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算清除率。

1.3.3 對(duì)·OH的清除效果 ·OH利用Fe2+和H2O2的反應(yīng)來(lái)制備，產(chǎn)生的·OH與水楊酸反應(yīng)，生成有顏色的物質(zhì)，根據(jù)文獻(xiàn)[11，14]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以水作參比，在510 nm測(cè)樣品AS。用1 mL重蒸水替代樣品做空白，測(cè)AC，用VC作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算清除率。

1.3.4 還原力的效果 根據(jù)文獻(xiàn)[11，15]考察還原力。取1 mL黃酮樣液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用水作參比，在700 nm處測(cè)樣品AS?？瞻讓?shí)驗(yàn)用1 mL蒸餾水取代樣品，測(cè)AC，用VC作陽(yáng)性對(duì)照。還原力按下式計(jì)算。

還原力=AS-AC

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的影響 準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入濃度分別為40%，50%，60%，70%，80%，90%(V/V)的乙醇溶液，在100 W下超聲5 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，測(cè)定各個(gè)吸光度，計(jì)算得率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration

由圖1可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮得率先增大，后減小，在70%時(shí)達(dá)到最大。乙醇濃度在某一范圍內(nèi)可以提高黃酮的提取效率，但是超過(guò)這個(gè)范圍就不能增加得率，這與相似相溶原理有很大關(guān)系。

2.1.2 料液比的影響 準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，分別按液料比20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 mL/g，加入50%乙醇，混勻后，在100 W下超聲5 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 液料比的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid

由圖2可知，隨液料比增大，黃酮得率先增大后減小。說(shuō)明合適的液料比有助于有效成分快速溶出，料液比50∶1 mL/g時(shí)得率最大。

2.1.3 超聲功率的影響 準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，分別在不同超聲功率下處理5 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power

由圖3可知，隨超聲功率增加，得率先增加后減小，200 W時(shí)達(dá)到最大?？赡苁怯捎邳S酮結(jié)構(gòu)會(huì)受到較大功率的破壞；也可能是功率過(guò)大，產(chǎn)生的熱量過(guò)多，溫度升高，導(dǎo)致乙醇溶液濃度減小。

2.1.4 超聲時(shí)間的影響 準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，在100 W下分別超聲1，3，5，7，9，11 min，于40 ℃水浴下浸提30 min，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time

由圖4可知，超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率影響不太顯著，但當(dāng)超聲10 min時(shí)得率最大。故為了節(jié)約能源，增大得率，采用10 min為宜。

2.1.5 水浴溫度的影響 準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，在100 W下超聲5 min，于不同水浴溫度下浸提30 min，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 水浴溫度的影響Fig.5 Effect of extraction temperature

由圖5可知，在50 ℃時(shí)達(dá)到得率最高，但隨后顯著下降。溫度升高，熱運(yùn)動(dòng)加快，得率增大；溫度過(guò)高，破壞黃酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致待測(cè)物損失，且能量消耗亦增大。故以水浴溫度50 ℃提取為宜。

2.1.6 水浴時(shí)間的影響 準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按液料比30∶1 mL/g加入50%乙醇溶液，在100 W下超聲5 min，于40 ℃水浴下浸提，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，延長(zhǎng)提取時(shí)間，黃酮得率增大，40 min 時(shí)得率最高。提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成溶劑揮發(fā)，影響提取效果，同時(shí)也造成能量浪費(fèi)。故選擇40 min為宜。

圖6 水浴時(shí)間的影響Fig.6 Effect of extraction time

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲功率、液料比、乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2?；貧w模型方程為：Y=19.23-0.32A-3.200E-003B-0.012C+0.069AB+0.37AC+0.27BC-1.78A2-1.23B2-1.50C2，模型方差分析見(jiàn)表3。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels ofBox-Behnken experimental

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著(P<0.000 1，<0.01)，失擬項(xiàng)P值為0.245 7，不顯著，表明此模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好，無(wú)其他因素的顯著影響。決定系數(shù)R2=0.985 4，表明經(jīng)過(guò)二次回歸模型方差分析，有98.54%的理論值能由模型來(lái)解釋。模型CV值1.57%很低，即表明該模型精密度高，且所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，即黑苦蕎麥黃酮的提取實(shí)驗(yàn)可用該模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。從P值大小可知，各因素的影響強(qiáng)弱為：超聲功率>乙醇濃度>液料比。一次項(xiàng)中A，即超聲功率對(duì)得率影響極顯著(P=0.011 6，<0.01)，交互項(xiàng)中AC的影響顯著(P=0.029 8，<0.05)。

2.2.2 響應(yīng)面圖解析 圖7表示乙醇濃度、液料比、超聲功率在一個(gè)因素固定不變的情況下，三個(gè)因素中的兩兩相互作用對(duì)黃酮提取效果的影響。

圖7 乙醇濃度、液料比、超聲功率及其兩兩相互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 The response surface graph showingthe effects of single factors and their interactionon the yield of flavonoids

由圖7可知，超聲功率與乙醇濃度的交互作用明顯，曲線較陡，這也與表3的方差分析一致。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面軟件給出的提取最適條件為：超聲功率195.40 W，液料比49.95∶1 mL/g，乙醇濃度69.92%時(shí)，黃酮得率預(yù)測(cè)值為19.23 mg/g干重?？紤]到生產(chǎn)實(shí)際，條件修整為：超聲功率 200 W，液料比50∶1 mL/g，乙醇濃度70%，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，得率平均值為19.31 mg/g干重，與模型給出的預(yù)測(cè)值十分接近，表明可以用此模型來(lái)模擬實(shí)驗(yàn)，并對(duì)黃酮得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究

2.3.1 清除DPPH的效果 由圖8可知，隨黃酮和VC濃度增大，二者對(duì)DPPH的清除逐漸增大，而后均趨于平衡，且黑苦蕎麥黃酮對(duì)DPPH的清除效果比VC略差，但同樣具有較好的對(duì)DPPH清除效果。

圖8 黑苦蕎麥總黃酮和VC對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.8 The scavenging effect of flavonoidsand VC on DPPH radical

2.3.2 清除·O2-的效果 由圖9可知，本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率與黃酮濃度呈正比，VC亦是。黑苦蕎麥黃酮對(duì)·O2-有一定的清除效果，但稍差于VC。

圖9 黑苦蕎麥總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除能力Fig.9 The scavenging effect of flavonoids and VCon superoxide anion radical

2.3.3 清除·OH的效果 由圖10可知，黑苦蕎麥黃酮對(duì)·OH有很好的清除作用，且清除率與物質(zhì)濃度成正比，且效果優(yōu)于VC。

圖10 黑苦蕎麥總黃酮對(duì)羥基自由基清除能力Fig.10 The scavenging effect of flavonoids and VC onscavenging hydroxyl radicals

2.3.4 還原力的效果 在一定濃度區(qū)間，吸光度值越大，目標(biāo)物的還原力也就越大。由圖11可知，在濃度100～800 μg/mL之間時(shí)，黑苦蕎麥黃酮已與VC的還原力非常接近，表明其對(duì)Fe3+具有較好的還原作用。

圖11 黑苦蕎麥總黃酮和VC的還原力Fig.11 The reducing ability of flavonoids and ascorbic acid

由上可知，黑苦蕎麥黃酮表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化作用，尤其能很好地清除·OH，且優(yōu)于VC。

3 結(jié)論

(1)黑苦蕎麥總黃酮最適提取條件為：乙醇濃度70%(V/V)，液料比50∶1 mL/g，超聲功率200 W，超聲時(shí)間10 min，水浴溫度50 ℃，水浴時(shí)間40 min。在此條件下，黃酮得率19.31 mg/g干重。

(2)黑苦蕎麥黃酮表現(xiàn)出很好的·OH清除效果，且好于VC；對(duì)DPPH、·O2-具有一定清除效果，對(duì)Fe3+具有一定還原能力，但效果都比VC略差。