譚力銘,裴海生,趙丹丹,胡高爽,郝建雄,*,張敬軒

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050000;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院,北京 100121;3.河北省食品質(zhì)量與安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心,河北石家莊 050000)

酸棗仁(ZiziphusjujubaMill.var.spinosa)為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子,采收成熟酸棗,除去果肉,碾碎果核,取出種子,曬干而成[1]。酸棗的產(chǎn)地主要位于河北、河南、陜西、內(nèi)蒙古等地。酸棗仁被認(rèn)定為藥食同源食品,其中蛋白質(zhì)含量約為36%,并含有三萜類、甾醇、酸棗仁皂甙等多種功能性物質(zhì)[2],營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。酸棗仁有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、斂汗、降壓作用[3]。目前對(duì)于酸棗仁的研究主要集中于黃酮、皂苷和生物堿等成分以及藥理作用[4]。

超微粉碎技術(shù)是近年來(lái)國(guó)際上一種較為成熟的新型食品加工技術(shù),應(yīng)用領(lǐng)域較為廣泛。超微粉碎技術(shù)不同于以往的常規(guī)機(jī)械粉碎,其特點(diǎn)是使物料快速、高效、瞬時(shí)地完成粉碎,更好地保持物料原有的理化性質(zhì)和活性成分[5],同時(shí)顆粒的細(xì)微程度使得物料的孔隙率和表面積有所改變,從而使物料具有良好的吸附性、比表面積、溶解性、粒徑均勻[6-7]。劉彩兵等[8]通過(guò)對(duì)米糠的粗粉碎和沖擊粉碎對(duì)比,發(fā)現(xiàn)沖擊粉碎的米糠中蛋白質(zhì)、氨基酸等含量有較大增加,且超微粉顆粒分散度高、粒徑均勻。司玉慧[9]研究不同超微粉碎方法對(duì)大豆分離蛋白功能特性的影響,發(fā)現(xiàn)超微粉碎可以使粉體顆粒比表面積增大、粒徑減小,粉體峰值溫度升高,熱焓值降低,說(shuō)明此時(shí)樣品中蛋白質(zhì)已一定程度伸展。冷凍粉碎技術(shù)是目前比較流行的一種技術(shù),在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用十分廣泛。低溫冷凍可以較完整的保留食品的色、香、味以及活性物質(zhì)[10-11],冷凍粉碎可以極大地保留食品的營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分[12],避免物料在高轉(zhuǎn)速粉碎條件下產(chǎn)熱而導(dǎo)致氧化、分解、變色、變性[13],使常溫條件下難以粉碎的物料得到充分粉碎,同時(shí)利用超低溫脆性使得物料粉碎達(dá)到更細(xì)微的程度。Bellik等[13]通過(guò)對(duì)比普通研磨和低溫研磨對(duì)提取香茅葉中揮發(fā)性油的影響,發(fā)現(xiàn)低溫研磨可以顯著提高揮發(fā)性油的提取率,且主要成分和化學(xué)類別存在變化。

關(guān)于酸棗仁蛋白提取,前人大多集中于普通粉碎方法-常規(guī)機(jī)械粉碎,普通粉碎方法的缺陷在于使酸棗仁蛋白微觀結(jié)構(gòu)未完全打開,導(dǎo)致蛋白提取率不理想[14]。本研究以酸棗仁渣為原料,經(jīng)超微冷凍粉碎、脫脂得到的脫脂酸棗仁粉作為研究對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析,建立酸棗仁蛋白提取率的數(shù)學(xué)模型,對(duì)其酸棗仁蛋白提取工藝進(jìn)行研究,旨在為酸棗仁蛋白的提取工藝奠定一定的理論基礎(chǔ),為酸棗加工副產(chǎn)物再利用提供一個(gè)新的開發(fā)方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁渣 河北省邢臺(tái)市潤(rùn)玉食品有限公司提供;牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250 生化純,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;鹽酸、氫氧化鈉 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;石油醚 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HC-3018高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;RT-25型氣流式超微粉碎機(jī) 榮聰精密科技有限公司;LGJ-10D型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;SPECTRO star Nano酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG LABTECH公司;ST2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁渣前處理 普通粉碎:取200 g酸棗仁渣放入粉碎機(jī),粉碎1 min,過(guò)80目篩,收集密封放入4 ℃冰箱備用。

超微冷凍粉碎:取200 g酸棗仁渣以液氮為冷源通入粉碎機(jī),打粉1 min,過(guò)80目篩。將粗粉碎的酸棗仁渣放入氣流式超微粉碎機(jī),以液氮為冷源通入超微粉碎機(jī),電流設(shè)置5 A,粉碎1 min,過(guò)150目篩,收集密封放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 脫脂酸棗仁粉的制備 將粉碎好的酸棗仁粉與石油醚按料液比1∶3 (g/mL),50 ℃水浴浸提30 min,離心(4000 r/min、10 min)去除上清液,重復(fù)多次,直到上清液完全澄清透明,室溫通風(fēng)12 h,40 ℃干燥12 h,得到脫脂酸棗仁粉,收集密封放入-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 脫脂酸棗仁蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》(凱氏定氮法)[15]。

1.2.4 酸棗仁蛋白的制備 參考趙杰昌[16]的方法,略有改進(jìn)。稱取1 g脫脂酸棗仁粉,按比例溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)溶液一定pH,在一定溫度下水浴攪拌浸提一定時(shí)間,離心(5000 r/min、20 min)得上清液,調(diào)節(jié)溶液值至酸棗仁蛋白等電點(diǎn),4 ℃靜置2 h,離心得到酸棗仁蛋白沉淀,冷凍干燥得到酸棗仁蛋白。酸棗仁蛋白提取率計(jì)算:

式中:W表示酸棗仁蛋白提取率,%;m表示提取得到的蛋白質(zhì)量,g;M表示脫脂酸棗仁粉中蛋白質(zhì)量,g。

1.2.5 酸棗仁蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定 稱取一定脫脂酸棗仁粉,按液料比30∶1 (mL/g)溶解于蒸餾水中、pH10.0、55 ℃攪拌浸提50 min,離心(5000 r/min、20 min)得上清液,分兩組用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8,4 ℃靜置2 h后離心(5000 r/min、15 min),通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定酸沉前和酸沉后上清液中酸棗仁蛋白的質(zhì)量。酸棗仁蛋白的沉淀率計(jì)算:

式中:P表示酸棗仁蛋白沉淀率,%;m1表示酸沉前上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量,g;m2表示酸沉后上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量,g。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn) 對(duì)于堿溶酸沉法提取蛋白質(zhì),考察液料比、pH、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響,按1.2.4酸棗仁蛋白制備方法,并設(shè)置重復(fù)試驗(yàn)。按液料比(mL/g)15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1,pH10,提取溫度55 ℃,提取時(shí)間50 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn);按pH8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,液料比30∶1,提取溫度55 ℃,提取時(shí)間50 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn);按提取溫度45、50、55、60、65 ℃,液料比30∶1,pH10,提取時(shí)間50 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn);按提取時(shí)間30、40、50、60、70 min,液料比30∶1,pH10,提取溫度50 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn) 基于單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,以液料比(A)、pH(B)、溫度(C)、時(shí)間(D)為影響因素,酸棗仁蛋白提取率(R1)為響應(yīng)值,試驗(yàn)因素及水平因素編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Origin Pro 8.0、SPSS Statistics 22.0和Design-Expert11對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通粉碎與超微冷凍粉碎對(duì)酸棗仁蛋白提取率影響

以液料比(mL/g)30∶1、pH10、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間50 min為提取條件,經(jīng)3次驗(yàn)證性試驗(yàn),普通粉碎方法的酸棗仁蛋白平均提取率為69.71%±0.21%,經(jīng)過(guò)超微冷凍粉碎的酸棗仁蛋白平均提取率為76.56%±0.30%,主要因?yàn)槌⒎鬯榭梢云茐奈锪霞?xì)胞結(jié)構(gòu),使蛋白等內(nèi)容物的比表面積增大,粒度較小且均勻[5,17-18],從而促進(jìn)蛋白在堿液中的溶解度,使得蛋白提取率提高。同時(shí)冷凍粉碎使蛋白活性保持較好且使物料產(chǎn)生脆性,有利于破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),所以超微冷凍粉碎方法可以顯著提高蛋白提取率。雖然此方法復(fù)雜且投資較大,但由于蛋白類物質(zhì)容易變性失活,為保證提取工藝的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性,同時(shí)保證工作的高效進(jìn)行,采用既能大量提取蛋白又能保證蛋白活性的超微冷凍粉碎法是較為理想的提取方式。

2.2 脫脂酸棗仁中蛋白質(zhì)含量及酸棗仁蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定脫脂酸棗仁蛋白質(zhì)含量為(73.42±0.23) g/100 g,蛋白質(zhì)含量較高,由此得出該原料開展后續(xù)酸棗仁蛋白提取工藝研究具有實(shí)際意義。

由圖1可以看出,蛋白沉淀率隨著pH的升高而增大,在pH為4.5的附近達(dá)到最大值,之后隨著pH的繼續(xù)升高而緩慢減小。因此酸棗仁蛋白等電點(diǎn)為pH4.5左右。這是因?yàn)樗釛椚实鞍兹芤涸诘入婞c(diǎn)時(shí),其分子以兩性離子的形式存在,正負(fù)離子在溶液中不斷溶解和溶出,但此時(shí)的正負(fù)離子數(shù)相等[19],其溶解度最小,最易形成蛋白質(zhì)沉淀[20]。從圖2可以更準(zhǔn)確地看出,酸棗仁蛋白沉淀率在pH為4.6時(shí)達(dá)到最大值,即酸棗仁蛋白等電點(diǎn)為pH4.6,為后續(xù)工藝優(yōu)化提供試驗(yàn)參數(shù)。

圖1 酸棗仁蛋白等電點(diǎn)(pH3.0～6.0)

圖2 酸棗仁蛋白等電點(diǎn)(pH4.3～4.8)

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 液料比對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖3可知,液料比(mL/g)在15∶1～30∶1之間,蛋白提取率隨液料比的增加而逐漸升高,主要原因是因?yàn)殡S著液料比的增大溶液的黏度隨之減小,分子的擴(kuò)散速率增大[21],酸棗仁蛋白充分溶解于溶劑中,從而使酸棗仁蛋白的提取率升高,當(dāng)液料比超過(guò)30∶1 (mL/g)后,酸棗仁蛋白提取率逐漸減小,且由于液料比過(guò)高導(dǎo)致浪費(fèi)程度加大,不利于工業(yè)化生產(chǎn),故選較優(yōu)液料比為30∶1 (mL/g)。

圖3 液料比對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響

2.3.2 pH對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖4可知,pH在8～11之間時(shí),蛋白提取率隨pH的增大而增加,主要原因是因?yàn)榈鞍自谌鯄A性條件下,酸棗仁蛋白在溶劑中的溶解性較好、分散性好[22]。而當(dāng)隨著pH升高并到達(dá)一定值時(shí),會(huì)導(dǎo)致酸棗仁蛋白天然結(jié)構(gòu)的改變,使得在溶劑中的溶解度下降,并會(huì)引起酸棗仁蛋白功能活性降低[23],故選較優(yōu)pH為11。

圖4 pH對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響

2.3.3 提取溫度對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖5可知,當(dāng)提取溫度在45～50 ℃之間時(shí),酸棗仁蛋白的提取率隨溫度的升高而增大,主要原因是因?yàn)楫?dāng)溫度升高,溶液黏度降低,體系分散度升高,使得酸棗仁蛋白溶解度提高[16],蛋白提取率隨之升高。當(dāng)溫度高于50 ℃后,蛋白提取率隨著溫度的升高而逐漸降低并趨于平緩,是因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致酸棗仁蛋白變性,從而降低其在溶劑中的溶解度,導(dǎo)致蛋白提取率降低,故可以得出,提取溫度不宜過(guò)高,因此選取較優(yōu)溫度值為50 ℃。

圖5 提取溫度比對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖6可知,提取時(shí)間在30～60 min之間時(shí),蛋白提取率隨提取時(shí)間的升高而增大,而當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min后,蛋白提取率隨提取時(shí)間的升高而減小,主要原因可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增大,酸棗仁蛋白得到充分的溶解,當(dāng)溶解度達(dá)到一定值時(shí),酸棗仁蛋白在溶劑中的溶出率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[24],且由于過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的受熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分發(fā)生變性,降低酸棗仁蛋白在溶劑中的溶解度。由于50與60 min無(wú)顯著性差異,且50與40、70 min無(wú)顯著性差異,但60與40、70 min存在顯著性差異,故選擇60 min較為合適,50與60 min兩組誤差線相比,60 min數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確,故選擇較優(yōu)提取時(shí)間為60 min。

圖6 提取時(shí)間對(duì)酸棗仁蛋白提取率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,確定4因素3水平的響應(yīng)面分析方法,酸棗仁蛋白提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.1 回歸模型建立與方差分析 通過(guò)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù),得到酸棗仁蛋白提取率(R1)與液料比(A)、pH(B)、提取溫度(C)和提取時(shí)間(D)的回歸方程:

R1=77.93+1.18A+1.61B+0.2151C-0.2889D-0.5021AB+0.6603AC+0.342AD-0.5193BC-0.2830BD-0.1181CD-1.41A2-1.84B2-0.8083C2-0.8269D2,對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

圖7 液料比與pH的交互作用對(duì)酸棗仁蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

該模型的F=60.89,P<0.0001差異極顯著,且失擬項(xiàng)P=0.0871>0.05,不顯著,決定系數(shù)R2為0.9838,說(shuō)明回歸方程擬合度和可信度很高,可用于范圍內(nèi)預(yù)測(cè)。由表3回歸模型系數(shù)的顯著性分析,將不顯著項(xiàng)剔除,簡(jiǎn)化后的回歸方程為:

R1=77.93+1.18A+1.61B+0.2151C-0.2889D-0.5021AB+0.6603AC+0.342AD-0.5193BC-1.41A2-1.84B2-0.8083C2-0.8269D2

分析對(duì)比一次項(xiàng)的F值,得出4個(gè)單因素對(duì)酸棗仁蛋白提取率影響大小順序?yàn)?C0.05)。而模型的二次項(xiàng)的影響均極顯著(P<0.01)。

2.4.2 響應(yīng)面分析 經(jīng)Deign-Expert 11軟件處理,得到液料比(A)、pH(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)交互作用的響應(yīng)面及等高線圖。

如圖7～圖10所示,酸棗仁蛋白提取率隨著液料比、pH、提取溫度和提取時(shí)間的升高,蛋白提取率都出現(xiàn)先升高后減小的趨勢(shì),可以推斷出獲得較高蛋白提取率,液料比應(yīng)在30∶1～32.5∶1 (mL/g)之間,pH應(yīng)在11.5附近,提取溫度應(yīng)在50 ℃左右,提取時(shí)間應(yīng)在60 min附近。

圖8 液料比與提取溫度的交互作用對(duì)酸棗仁蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖9 液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)酸棗仁蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖10 提取溫度與pH的交互作用對(duì)酸棗仁蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖7的等高線圖則出現(xiàn)較完整的橢圓形,且響應(yīng)面的曲面降幅較大、傘形明顯,表示AB的交互作用對(duì)蛋白提取率影響為極顯著;圖8和圖10的等高線圖呈較扁的橢圓形,即AC和BC的交互作用對(duì)蛋白提取率影響為極顯著;而圖9的等高線圖則出現(xiàn)較規(guī)則橢圓形[25],表示液料比與提取時(shí)間交互作用對(duì)蛋白提取率影響為顯著,此都與方差分析結(jié)果吻合。

由所得到的模型,經(jīng)Design-Expert 11軟件處理得到蛋白提取率最高的相應(yīng)各參數(shù)值為:液料比31.86∶1 (mL/g)、pH11.38、提取溫度50.87 ℃、提取時(shí)間58.24 min,最大理論蛋白提取率為78.50%。經(jīng)過(guò)修正確定最終工藝參數(shù)為液料比32∶1 (mL/g)、pH11.4、提取溫度51 ℃、提取時(shí)間58 min。此條件下重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn),酸棗仁蛋白平均提取率為78.47%±0.17%,與理論值接近,表明該回歸模型對(duì)優(yōu)化酸棗仁蛋白的提取工藝可行,可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

3 結(jié)論

在相同提取條件下,普通粉碎方法的酸棗仁蛋白平均提取率為69.71%±0.21%,經(jīng)過(guò)超微冷凍粉碎的酸棗仁蛋白平均提取率為76.56%±0.30%,超微冷凍粉碎方法顯著提高了蛋白提取率(P<0.05)。由于蛋白類物質(zhì)容易變性失活,為保證工廠工藝的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性,采用既能大量提取蛋白又能保證蛋白活性的超微冷凍粉碎法是較為理想的提取方式。

脫脂酸棗仁粉中蛋白質(zhì)含量為(73.42±0.23) g/100 g,其中蛋白質(zhì)含量較高,保留較好,酸棗仁蛋白等電點(diǎn)為pH4.6。

采用超微冷凍粉碎進(jìn)行前處理,經(jīng)Design-Expert 11軟件分析得出4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率影響由大到小順序?yàn)?pH、液料比、提取時(shí)間、提取溫度。由得到的回歸模型對(duì)酸棗仁蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳提取工藝條件為液料比32∶1 (mL/g)、pH11.4、提取溫度51 ℃、提取時(shí)間58 min。在此條件下重復(fù)3組試驗(yàn),實(shí)際酸棗仁蛋白平均提取率為78.47%±0.17%,與理論值較為接近,表明該回歸模型對(duì)優(yōu)化酸棗仁蛋白的提取工藝可行,可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn),相較前報(bào)道的酸棗仁蛋白提取工藝研究,蛋白提取率有明顯提高。