李宏霞，段小群，李婷

（1.桂林醫(yī)學院，廣西 桂林；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林）

0 引言

伊馬替尼（Imatinib）是一種酪氨酸激酶抑制劑，可以特異性地作用于BCR-ABL 酪氨酸激酶，是CML 的一線治療藥物，也可用于胃腸道基質(zhì)瘤（GIST ）的治療。

甲磺酸伊馬替尼，化學名：4-[（4- 甲基-1- 哌嗪）甲基]-N-[4- 甲基-3-[[4-（3- 吡啶）-2- 嘧啶] 氨基] 苯基]苯甲酰胺甲磺酸鹽。分子式與分子量：C29H31N7O·CH4SO3；589.7。甲磺酸伊馬替尼原料藥為白色至淡黃色結(jié)晶性粉末；無臭；本品在水中易溶，在甲醇中溶解，在異丙醇中幾乎不溶，在0.1mol/L 的鹽酸溶液中易溶；pH4.5-6.0；本品的熔點為220～226℃[1]。

1 色譜條件及質(zhì)譜條件

現(xiàn)今液質(zhì)聯(lián)用廣泛用于測定血漿中藥物濃度，考慮其具有高效分離、高選擇性、高靈敏性，故用來伊馬替尼定量分析。文獻報道中主要常用的LC-MS/MS 儀器來源有Agilent、Waters、AB Sciex、SHIMADZU。

圖1 甲磺酸伊馬替尼化學結(jié)構(gòu)式

表1、表2 是本綜述總結(jié)的相關(guān)研究中液質(zhì)聯(lián)用的主要信息。通過整合以下文獻中的信息可初步確定主要的液相條件和質(zhì)譜條件。質(zhì)譜條件：MRM,ESI+，離子對大致是494 →394。 液 相 條 件：色 譜 柱，ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm,3.5μm)；流動相B，乙腈，流動相A：0.1%甲酸&5mM 乙酸銨水溶液；流速1.0 mL-min-1；柱溫40℃。

表1 研究中的質(zhì)譜條件

2 標準品和內(nèi)標

從可追溯的來源獲得標準品。標準品應帶有分析證書（Certificate of Analysis)包括純度，儲存條件、失效日期和批號等。LC-MS/MS 生物分析要使用內(nèi)標應盡可能使用穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標。在最近幾年的文獻中多采用氘代化合物作為內(nèi)標。因此推薦采用伊馬替尼-D8 作為內(nèi)標。

3 采樣點的選擇

表2 研究中的色譜條件

甲磺酸伊馬替尼在空腹給藥后大約2-4h 內(nèi)達到血漿峰濃度，食物對吸收影響的研究顯示，與空腹時比較，高脂飲食后伊馬替尼吸收率輕微降低（Cmax 減少11%，tmax 延后1.5h）[2]。考慮高脂餐的影響，伊馬替尼可在清淡飲食后給藥。

根據(jù)《化學藥物臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則》（2005）要求，一個完整的血藥濃度-時間曲線，應包括藥物各時相的采血點，即采樣點應包括給藥后的吸收相，峰濃度附近和消除相。一般在吸收相至少需要2～3 個采血點，峰濃度附近至少需要3 個采血點，消除相至少需要3～5 個采血點，總共一般不少于11～12 個采血點。根據(jù)《以藥動學參數(shù)為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導原則》（2016），建議每個周期采樣12～18 個采血點，采樣時間不短于3 個消除半衰期。

伊馬替尼的消除半衰期約為18 h，取樣時間點可以以伊馬替尼原型藥物半衰期計算，以3～5 個半衰期為宜[5]。伊馬替尼空腹給藥后大約2-4h 內(nèi)達到血漿峰濃度，餐后給藥延后約1.5h，宜在給藥2～5.5h 密集采點。

根據(jù)其文獻報道伊馬替尼給藥后72h 血藥濃度仍在可測標曲范圍內(nèi)，因此采樣結(jié)束時間宜設(shè)置在給藥后72h。綜合以上藥代動力學參數(shù)及查閱參考文獻可設(shè)計采血點如下：每周期于給藥前（0h，服藥前1.0h 內(nèi)）和給藥后0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h、6.0h、7.0h、8.0h、12.0h、24.0h、36h、48h、72h，共20 個時間點采集靜脈血約4mL。

根據(jù)原研產(chǎn)品數(shù)據(jù)，伊馬替尼的消除半衰期約為18 h，其活性代謝產(chǎn)物半衰期約為40h，七天內(nèi)約可排泄所給藥物劑量的81%，為避免前一周期的攜帶效應，清洗期宜為設(shè)為10～14d。

4 前處理及進樣分析

在目前報道的前處理方法中蛋白沉淀法是LC-MS 最常使用的方法之一，其中又最常用有機溶劑沉淀法，可使結(jié)合型的藥物釋放，減少乳化，保護儀器性能。甲醇和乙腈是最常用的沉淀劑，其中乙腈的沉淀更致密，沉淀更完全。推薦沉淀劑體積比例：含藥物的血漿與甲醇的體積比大于1：3，含藥物的血漿與乙腈的體積比大于1：2。推薦離心轉(zhuǎn)速：大于10000rpm/min。

前處理中的溶劑體系盡量與流動相保持一致，變換不同的有機試劑進行以及不同的蛋白沉淀比例，進行前處理；采用相應的有機試劑作為流動相進樣分析，確定藥物是否從結(jié)合物中釋放，以及化合物峰分離以及響應情況，推斷是否測定出藥物總濃度；由基質(zhì)響應確定是否通過前處理將樣品純化、富集并消除基質(zhì)干擾。

5 標準曲線范圍

定量下限是標準曲線的最低點，是能夠被可靠定量的樣本中伊馬替尼的最低濃度，具有可接受的準確度和精密度，應適用于預期的濃度和試驗目的。標準曲線濃度范圍應盡量覆蓋預期濃度范圍。如果臨床試驗單次給藥藥量為100mg，則可將標曲范圍初步定為5～1500 ng·mL-1。

在根據(jù)實際給藥總量和參考表3 及其他相關(guān)研究后確定標曲范圍，然后進行驗證，具體的按照《中國藥典》2015年版第四部附錄9012《生物樣本定量分析方法驗證指導原則》中的要求進行確證。

6 數(shù)據(jù)處理

現(xiàn)在的藥代動力學/生物等效性研究中主要將數(shù)據(jù)通過WinNonLin 等進行藥代動力學參數(shù)計算。如Cmax/ng·L-1、t1/2/h、tmax/h、AUC0-72h/ng·h·L-1、AUC0-∞/ng·h·L-1。

由非房室模型計算各受試者的藥代參數(shù)。同時用Excel計算各參數(shù)的算術(shù)均數(shù)、標準差、變異系數(shù)、中位數(shù)、最小值、最大值和幾何均數(shù)。主要藥代參數(shù)（Cmax、AUC）經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析（ANOVA），計算兩藥主要藥代參數(shù)的幾何平均值比值的90%置信區(qū)間，并進行等效性比較，等效區(qū)間設(shè)定為80.00%～125.00%。

表3 研究中的標曲范圍

7 總結(jié)

通過以上文獻等其他資料，可獲得目前伊馬替尼的母離子質(zhì)荷比、主要子離子質(zhì)荷比、極性、離子化方式、分子式、結(jié)構(gòu)式、溶解度等詳細信息，進行方法開發(fā)?？衫冕槺眠M樣，通過MRM 優(yōu)化化合物參數(shù)，或手動優(yōu)化，選擇合適的MS 方法；通過LC-MRM，進行色譜條件優(yōu)化，選擇合適的LC-MS方法；最后選擇合理的前處理方法進行樣品配制。

初步確定方法后，進行方法學驗證，驗證項目：選擇性、標準曲線、定量下限、精密度、準確度、提取回收率、基質(zhì)效應、穩(wěn)定性、系統(tǒng)殘留和稀釋可靠性。

臨床試驗采樣點的確定主要考慮藥物達峰時間和藥物半衰期，也需要考慮食物的影響。將通過合理的臨床試驗采樣后的血樣前處理后進樣分析，最后將數(shù)據(jù)通過Excel、WinNonLin 等進行處理。最后獲得藥物的藥代動力學特征，判定藥物的生物等效性。

8 討論

一個合理的藥代動力學/生物等效性試驗或?qū)嶒灧桨傅脑O(shè)計，主要包括采樣計劃和生物分析計劃，是在大量的文獻資料的基礎(chǔ)上，綜合考慮臨床、實驗室、藥物、儀器等相關(guān)因素后建立的。其中伊馬替尼的血藥濃度檢測雖有大量的研究文獻支持，但不同的試驗或?qū)嶒瀸ο?、不同基礎(chǔ)、不同的地點、不同的儀器等的變化，仍然需要具體問題具體分析，方法學驗證也應根據(jù)具體情況進行全部驗證或部分驗證。