黃偉華，吳碧球，顏梅新

(1.廣西農業(yè)科學院生物技術研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物病蟲害生物學重點實驗室/廣西農業(yè)科學院植物保護研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】荸薺屬莎草科多年生草本植物，廣泛栽培于我國和印度，美國、澳大利亞和日本等國亦有種植[1-2]。荸薺球莖含有豐富的碳水化合物，可作為水果和蔬菜食用，亦可作藥物用于治療便秘、喉炎和咽炎等[3]。然而稈枯病菌(Cylindrosporiumeleocharidis)引起的荸薺稈枯病(俗稱荸薺瘟)發(fā)生普遍，引起荸薺產量和品質降低，影響荸薺產業(yè)的健康發(fā)展[4-5]，但迄今對該菌分子水平的研究涉及較少，對其致病機理了解甚少，影響了防治水平的提高。因此，建立荸薺稈枯病菌的遺傳轉化體系及構建覆蓋全基因組的突變體庫，對荸薺稈枯病菌的分子機理研究及其防治工作開展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】1962年美國首次報道荸薺稈枯病，其病原菌為C.eleocharidis[4]，我國江蘇省于1985年首次報道荸薺稈枯病的發(fā)生[6]，隨后廣西報道了荸薺稈枯病的發(fā)生與危害，并建立了荸薺稈枯病的發(fā)生和流行與氣溫、濕度、降量、露水等環(huán)境因素密切相關的預測模型[7]，湖北省報道了荸薺稈枯病的發(fā)生并對該病菌進行生物學研究[8]。目前，絲狀真菌遺傳轉化技術已成為植物病原真菌分子遺傳和基因功能研究的重要手段，由農桿菌介導的真菌遺傳轉化技術(ATMT)已成功應用于Fusariumoxysporum、Aspergillusjaponicus、Pseudocercosporafijiensis和Sporisoriumscitamineum等絲狀真菌[9-12]。農桿菌介導的真菌轉化方法相比其他幾種真菌轉化方法(PEG-MT、REMI和基因槍等)具有轉化受體可為多種類型、轉化效率較高、隨機單拷貝插入多及轉化子穩(wěn)定等優(yōu)點[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于根癌農桿菌介導荸薺稈枯病菌遺傳轉化體系建立及該菌突變體庫構建的研究未見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過建立高效的農桿菌遺傳轉化體系，構建該菌突變體庫，并對突變體進行表型及致病性篩選，為分子水平上研究荸薺稈枯病菌的基因功能及致病機理提供技術支持和研究材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株(荸薺稈枯病病原菌菌株Ceh)與雙元載體pEX4(含綠色熒光蛋白GFP)均由廣西農業(yè)科學院生物技術研究所實驗室保存提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 潮霉素B對菌株Ceh的抑制作用 將Ceh在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，利用打孔器從菌落邊緣打孔，挑取直徑8 mm菌塊分別接種于含不同濃度潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，7 d后觀察菌落的生長情況并測量菌落直徑。潮霉素B設0、10、20、50、100和150 μg/mL 6個濃度處理，每處理重復3次。

1.2.2 農桿菌介導菌株Ceh遺傳轉化 參照Sun等[11]的方法，并作適當修改。挑取含有雙元載體的根癌農桿菌單菌落，接種于加入壯觀霉素(50 μg/mL)和利福平(50 μg/mL)的MM液體培養(yǎng)液中，在200 r/min、28 ℃下培養(yǎng)48 h，用IM液體培養(yǎng)液稀釋OD600至約0.15，分別加入或不加AS，在200 r/min、28 ℃下預誘導培養(yǎng)6 h，測得OD600約為0.50時即可用于共培養(yǎng)。分別取上述農桿菌培養(yǎng)液和荸薺稈枯病菌孢子懸浮液各100 μl混合液涂在加入AS并覆蓋了纖維素濾膜的IM固體培養(yǎng)基上，28 ℃下共培養(yǎng)24～72 h。轉移纖維素濾膜至含有潮霉素B和頭孢噻肟鈉PDA的平板上，28 ℃下培養(yǎng)8～10 d，以獲得轉化子。將長出的單菌落用牙簽挑到含有潮霉素B的PDA上進行二次篩選。

1.2.3 農桿菌轉化效率影響因素優(yōu)化 設不同病菌孢子濃度(105、106、107、108和109個/mL)、IM培養(yǎng)基pH(2.5、5、5.3、5.6、6.0、6.5和7.0)、農桿菌誘導時間(0、2、4、6、8和10 h)、共培養(yǎng)介質(硝酸纖維素膜、玻璃紙、定性濾紙和Hybond-N膜)、誘導共培養(yǎng)時AS濃度(0、100、200、300和400 μmol/L)及共培養(yǎng)時間(48、72和96 h)等處理，進行優(yōu)化試驗，以上處理均設3次重復。試驗數據采用SPSS 22.0進行方差分析。

1.2.4 病原菌轉化子分子檢測 隨機選取荸薺稈枯病病原菌轉化子，采用真菌DNA提取試劑盒(OMEGA，D3690-01)提取突變體DNA。通過引物hph1 5′-GCCGATGGCTTCTACAAGGATAG-3′和hph2 5′-CTCACGATGGCATCGCACCT-3′對轉化子進行PCR檢測，其PCR反應程序和Southern blotting轉化子驗證參考Yan等的方法[14]。

1.2.5 病原菌轉化子熒光檢測 用接種環(huán)刮取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的病原菌Ceh，加入無菌水制成玻片，在熒光顯微鏡(Carl Zeiss，德國)下檢測熒光。

1.2.6 病原菌突變體菌落形態(tài)分析 將野生型菌株和轉化子置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，利用打孔器分別從菌落邊緣打孔，挑取直徑5 mm的菌餅接種至新PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)7 d，分析菌落形態(tài)。

1.2.7 病原菌突變體致病性測試 選取15 cm長并經75 %酒精消毒的荸薺新鮮莖稈，采用離體刺傷法，按照1.2.6中的方法挑取直徑5 mm的菌餅接種至莖稈傷口處，置于搪瓷盆中加濕水濾紙保濕，室溫放置，7 d后觀察莖稈發(fā)病情況，測量病斑面積。病原菌野生型和突變體接種處理均設3個重復。

圖1 荸薺稈枯病病原菌對潮霉素B敏感性測定結果Fig.1 Sensitivity of C. eleocharidis to hygromycin B

2 結果與分析

2.1 荸薺稈枯病病原菌菌株Ceh對潮霉素B的敏感性測定結果

從圖1可看出，病菌菌株Ceh在不含潮霉素B的PDA平板上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑平均為55 mm，而在含10 μg/mL以上潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上不能生長，說明病原菌菌株Ceh對潮霉素B較敏感。為確保農桿菌轉化體系的陽性轉化效率，本研究確定100 μg/mL為潮霉素最佳濃度。

2.2 不同因素對農桿菌轉化效率的影響

2.2.1 農桿菌與病原菌菌株Ceh共培養(yǎng)時間的影響 從圖2可看出，農桿菌與病原菌菌株Ceh共培養(yǎng)48 h時平均每個培養(yǎng)皿(9 cm)獲得20.0個轉化子，共培養(yǎng)72 h時獲得49.7個轉化子/皿，而當共培養(yǎng)時間延長至96 h時，可獲得70.3個轉化子/皿。方差分析結果表明，不同共培養(yǎng)時間處理間的轉化效率存在顯著差異(P<0.05，下同)。說明共培養(yǎng)時間越長，農桿菌介導病原菌菌株Ceh的轉化效率越高。

圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05)，the same as below圖2 共培養(yǎng)時間對農桿菌轉化效率的影響Fig.2 Effects of co-cultivation time for A.tumefaciens on transformation

2.2.2 IM固體培養(yǎng)中AS濃度的影響 農桿菌與病原菌菌株Ceh孢子等量混勻后在IM固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，結果(圖3)表明，當AS濃度為0時，平板上抗性菌落數為0；當AS濃度為200 μmol/mL時，獲得轉化子數為31.7個/皿；當AS濃度為300 μmol/mL時農桿菌轉化效率達最高值，獲得轉化子數為56.3個/皿，當AS濃度為400 μmol/mL時獲得的轉化子數反而減少(52.0個/皿)，但轉化效率仍較高。方差分析結果表明，不同IM固體培養(yǎng)基中AS濃度處理間轉化效率的差異顯著。說明隨著共培養(yǎng)基中AS濃度的提高，農桿菌的轉化效率也相應提高，本研究以IM固體培養(yǎng)中AS濃度300 μmol/mL為最佳濃度。

圖3 IM固體培養(yǎng)基中AS濃度對農桿菌轉化效率的影響Fig.3 Effects of acetosyringone(AS) concentration in IM cultivation medium on transformation efficiency

圖4 農桿菌誘導時間對農桿菌轉化效率的影響Fig.4 Effects of induce time for A.tumefaciens on transformation efficiency

2.2.3 農桿菌誘導時間的影響 從圖4可看出，當農桿菌誘導生長6 h時病原菌菌株Ceh的轉化效率最高，獲得轉化子數為31.6個/皿；其次是誘導8 h，可獲得轉化子12.0個/皿；最差的是誘導0 h，但仍可獲得轉化子1.3個/皿。方差分析結果表明，農桿菌誘導6 h處理的轉化效率與其他誘導時間處理間的轉化效率存在顯著差異，誘導10 h處理與誘導2 h和4 h處理間的轉化效率差異不顯著(P>0.05，下同)。說明農桿菌誘導生長時間不同對病原菌菌株Ceh的轉化效率存在差異，其中誘導時間為6 h對農桿菌轉化效率最高。

2.2.4 病原菌菌株Ceh孢子濃度的影響 從圖5可看出，農桿菌在誘導6 h時分別對105～109個/mL共5個濃度梯度的病原菌菌株Ceh孢子液進行了轉化，其中孢子濃度為107個/mL的孢子液轉化效率最高，可獲得轉化子77.7個/皿，低于或高于該濃度處理的轉化率均降低。方差分析結果表明， 105～109個/mL 5個孢子濃度處理間的轉化效率均存在顯著差異。說明農桿菌介導荸薺稈枯病菌遺傳轉化的最佳孢子濃度為107個/mL。

圖5 荸薺稈枯病病原菌孢子濃度對農桿菌轉化效率的影響Fig.5 Effects of the concentration of C. eleocharidis spore on transformation efficiency

圖6 共培養(yǎng)基pH對農桿菌轉化效率的影響Fig.6 Effects of pH in co-cultivation medium on transformation efficiency

2.2.5 共培養(yǎng)基pH的影響 從圖6可看出，在農桿菌誘導6 h、病原菌菌株Ceh孢子濃度為107個/mL條件下，當共培養(yǎng)基pH為5.6時可獲得轉化子72.7個/皿，而pH 在6.5和7.0時未獲得轉化子，農桿菌轉化率為0，不適合農桿菌轉化；在余下所測試pH下農桿菌轉化效率極低，獲得的轉化子數未超過12.0個/皿。方差分析結果表明，共培養(yǎng)基pH 5.6處理的轉化效率與其他pH處理間的轉化效率存在顯著差異，共培養(yǎng)基pH 4.5、5.0、6.5和7.0處理間的轉化效率差異不顯著?？梢姡谵r桿菌誘導6 h、病菌Ceh孢子濃度為107個/mL條件下共培養(yǎng)基pH為5.6最適宜農桿菌轉化。

2.2.6 不同共培養(yǎng)介質對農桿菌轉化效率的影響 分別使用玻璃紙、濾紙、Hybond-N膜、硝化纖維膜等4種共培養(yǎng)介質進行農桿菌轉化。結果顯示使用硝化纖維膜時轉化效率最高，可獲得轉化子35.0個/皿，其次是使用Hybond-N膜，獲轉化子11.0個/皿，使用玻璃紙和濾紙的農桿菌轉化效率最低，僅分別獲得轉化子3.0和4.6個/皿(圖7)。方差分析結果表明，硝化纖維膜處理的轉化效率與其他處理的轉化效率均存在顯著差異，Hybond-N膜處理與濾紙和玻璃紙?zhí)幚淼霓D化效率差異顯著，而濾紙和玻璃紙?zhí)幚黹g的轉化效率差異不顯著。說明不同濾膜對農桿菌轉化效率的影響存在差異，其中硝化纖維膜作為共培養(yǎng)介質時農桿菌轉化效率最高。

圖7 不同共培養(yǎng)介質對農桿菌轉化效率的影響Fig.7 Effects of co-cultivation substrate for A.tumefaciens on transformation efficiency

M：DNA Marker DL2000；1～13：隨機挑選的荸薺稈枯病菌轉化子；14：WT17即原始菌株；15：陰性對照；16：陽性對照 M：DNA marker DL2000；Lane 1-13：Randomly selectedtransformants of C. eleocharidis，Lane 14：WT17, wild type of C. eleocharidis;Lane 15：Negative control;Lane 16：Positive control圖8 荸薺稈枯病病原菌轉化子hph基因的PCR擴增電泳結果Fig.8 PCR detection for the presence of hph gene from randomly selected transformants of C. eleocharidis

2.3 病原菌菌株Ceh轉化子的PCR驗證

以雙元載體pEx4上的潮霉素基因(hph)為模板設計引物hph1和hph2對轉化子進行PCR擴增，結果(圖8)顯示轉化子均能擴增出目的條帶750 bp，說明T-DNA已插入荸薺稈枯病病原菌中。

2.4 病原菌菌株Ceh轉化子的Southern blotting雜交驗證

對隨機挑選的病原菌菌株Ceh轉化子及對照病原菌菌株Ceh的基因組DNA用于酶切、電泳和轉膜，以hph基因片段為探針進行雜交，以檢測外源T-DNA插入的拷貝數，結果(圖9)發(fā)現除對照無帶外，9個轉化子的Southern blotting雜交結果均為陽性，進一步證實外源T-DNA片段已成功轉入荸薺稈枯病菌的基因組DNA中。從圖9可看出，在插入的外源T-DNA突變體中，7個突變體為單拷貝，其余2個為雙拷貝，說明本研究中外源T-DNA插入的單拷貝率達77.8 %。

2.5 病原菌菌株Ceh轉化子的穩(wěn)定性測定結果

在所獲得的病原菌Ceh轉化子中隨機選取10.0個，在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代，再轉到含有潮霉素(100 μg/mL)的PDA平板上，轉化子仍能繼續(xù)生長，說明插入的外源T-DNA已整合到荸薺稈枯病菌的基因組中，且能隨著病原菌菌株Ceh的生長而復制。

M：1 kb marker；1～9：突變體；10：野生型菌株Ceh；11：陽性對照 M：1 kb marker；Lanes 1-9：Transformants of C. eleocharidis：Lane 10：Wild type Ceh；Lane 11：Positive control 圖9 荸薺稈枯病菌轉化子雜交帶型分析結果Fig.9 Hybrid banding patterns analysis on transformants of C. eleocharidis

2.6 病原菌菌株Ceh轉化子的熒光顯微鏡鑒定

將病原菌菌株Ceh轉化子菌落或孢子懸浮液置于熒光顯微鏡下觀察。從圖10可看出，經農桿菌轉化后的突變體在熒光顯微鏡紫外激發(fā)光下發(fā)出熒光(綠光)，說明農桿菌的GFP基因已成功轉到荸薺稈枯病原菌中并得以表達。

2.7 病原菌菌株Ceh突變體的菌落形態(tài)觀察結果

通過對轉化獲得的6325.0個病原菌菌株Ceh轉化子與野生型Ceh菌落形態(tài)進行對比，發(fā)現共有7個突變體菌落表型發(fā)生明顯變化(圖11)，其中突變體C2 菌落形態(tài)異常(菌落形態(tài)變小)，突變體C1和C3菌落顏色發(fā)生變化(由灰色變?yōu)榛野咨虬咨?，突變體C4、C5、C7和C6菌絲密度變化明顯(菌落菌絲由疏變密)。說明T-DNA的插入影響突變體形態(tài)相關基因的表達，從而導致突變體形態(tài)表現異常。

2.8 病原菌菌株Ceh突變體的致病性測定結果

本研究共測試6325.0個突變體，結果發(fā)現野生型菌株和多數Ceh突變體均能使荸薺莖稈產生水漬狀病斑，同時也獲得致病性缺陷突變體，其中，致病力喪失突變體4株，弱致病力突變體26株，致病力正常突變體和致病力缺陷突變體分別占總突變體數的99.53 %和0.47 %。從圖12可看出，致病力喪失的突變體為C189、C625、C51和C3638；弱致病力突變體為C4281和C2367，其所致病斑面積分別為3 mm×2 mm和4 mm×3 mm，明顯小于野生型菌株所致病斑面積(11 mm×5 mm)。說明以上6個突變體的致病性相關基因受到了不同程度的破壞，從而使突變體致病力喪失或降低。

A、C：紫外光條件下的熒光顯微照相；B、D：明場條件下的顯微照相 A，C：Fluorescence microscopy image under ultraviolet light；B，D：Fluorescence microscopy image under bright field圖10 根癌農桿菌轉化荸薺稈枯病菌獲得的轉化子熒光顯微鏡鑒定結果Fig.10 Fluorescence microscopy analysis of transformants of C. eleocharidis

圖11 突變體與野生型Ceh菌株的菌落形態(tài)比較Fig.11 Colony morphology comparison of wild type strain Ceh1 and the mutants

3 討 論

絲狀真菌遺傳轉化技術是研究植物病原真菌分子遺傳和基因功能的重要手段，而由農桿菌介導的真菌遺傳轉化技術(ATMT)已成功應用于Fusariumoxysporum、Aspergillusjaponicus、Pseudocercosporafijiensis和Sporisoriumscitamineum等絲狀真菌[9-12]。農桿菌介導的真菌轉化相比其他幾種真菌轉化方法(PEG-MT、REMI和基因槍等)具有轉化受體類型多(如分生孢子、原生質體、菌絲、甚至蘑菇的菌絲體組織等)、插入隨機性、陽性轉化效率高及T-DNA單拷貝率高等優(yōu)點[13]，從而使得農桿菌轉化技術成為建立覆蓋全基因組突變體庫的一個技術工具[10-11]。本研究運用農桿菌介導的真菌轉化方法成功將含有綠色熒光蛋白(GFP)的雙元載體pEX4轉化到荸薺稈枯病菌野生型菌株Ceh中；通過對農桿菌轉化影響因子的優(yōu)化，獲得最佳轉化條件：共培養(yǎng)基中AS濃度為300 μmol/L，農桿菌誘導時間為6 h，病菌孢子濃度為107個/mL，誘導培養(yǎng)基pH 5.6，共培養(yǎng)時間為72 h，共培養(yǎng)濾膜為硝酸纖維素膜；通過條件優(yōu)化，轉化效率(轉化子數)可達600～700個/107孢子。

農桿菌與病原菌混勻后進行共培養(yǎng)，此階段是農桿菌將自己的T-DNA往外向病菌運輸，并融合到病菌基因組DNA的過程，AS在此過程中發(fā)揮重要作用，可誘導農桿菌激活Vir基因，促進T-DNA整合到病菌基因組DNA[13，15]。本研究發(fā)現，農桿菌與病菌共培養(yǎng)時AS的有無是關鍵，在缺乏AS的情況下，未獲得轉化子。此外，共培養(yǎng)時間也是影響轉化效率的重要因素，但不同真菌由于自身生長特點不同，共培養(yǎng)時間也存在較大差異，如在農桿菌對木霉的遺傳轉化中，在共培養(yǎng)12 h條件下未獲得轉化子，共培養(yǎng)24 h僅獲得少量轉化子，共培養(yǎng)48 h 的轉化效率最高，而共培養(yǎng)時間高于48 h導致轉化率降低[16]。而在農桿菌介導黃瓜炭疽菌的遺傳轉化中，用較短的共培養(yǎng)時間(24 ℃黑暗24 h)其轉化效率反而更高。這是由于共培養(yǎng)時間越長，產生的菌絲越長，不容易從共培養(yǎng)的尼龍膜上洗掉，因而影響轉化效率[17]。本研究認為，在一定的時間范圍內(96 h)，共培養(yǎng)時間越長，轉化效率越高；在一定的真菌孢子濃度(107個/mL)下，共培養(yǎng)時間過長，轉化子數量增加過多，均不利于單菌落挑取，因此本研究選擇的最適共培養(yǎng)時間為72 h。

圖12 病原菌菌株Ceh突變體離體莖稈致病性的測定結果Fig.12 Pathogenicity test of the strain Ceh mutants in vitro stem

自綠色熒光蛋白GFP出現起，GFP及其衍生物已作為標記基因被廣泛應用于微生物研究領域。GFP在絲狀真菌中主要有幾個方面的應用：病原菌入侵寄主和致病等互作過程、調查真菌孢子中細胞核運動和分裂過程及觀察病原菌調控蛋白的移位等[18-21]。本研究采用農桿菌轉化方法成功將GFP基因導入荸薺稈枯病菌的基因組DNA中，因此，GFP蛋白可作為報告基因應用于荸薺稈枯病菌與寄主的互作研究中；通過多批次農桿菌轉化構建突變體庫，篩選表型和致病性缺陷突變體，可為突變基因克隆和功能分析提供研究材料。

4 結 論

成功建立了農桿菌介導荸薺稈枯病菌高效的遺傳轉化體系，并通過構建T-DNA插入突變體庫，篩選得到表型和致病性缺陷突變體，可作為開展荸薺稈枯病菌基因功能和病菌與寄主互作研究的參考依據。