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        浮萍原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立及其應(yīng)用研究

        2020-12-10 01:50:10宋樂(lè)元杜安平王海燕
        關(guān)鍵詞:原生質(zhì)浮萍擬南芥

        宋樂(lè)元,方 揚(yáng),田 潤(rùn),杜安平,王海燕*

        (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610065;2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041;3.四川維度創(chuàng)研生物科技有限公司,四川 成都 610041)

        【研究意義】浮萍是一種形態(tài)極其簡(jiǎn)單的小型開(kāi)花植物[1],其組織形態(tài)高度退化為“葉狀體”,但部分品種仍有“根莖葉花果實(shí)”的分化,具有高等植物同樣的復(fù)雜表達(dá)系統(tǒng)[2]。浮萍生長(zhǎng)速度極快,培養(yǎng)簡(jiǎn)單且成本低廉,也可無(wú)性繁殖。這不僅有利于遺傳穩(wěn)定性,還使其生物反應(yīng)器不受季節(jié)限制,可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)。【前人研究進(jìn)展】目前,研究者已對(duì)部分浮萍品系開(kāi)展了遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究,有2個(gè)品系的表達(dá)體系已經(jīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)抗體、藥用蛋白、人源化重組蛋白、生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)因子等[3]。浮萍的生物學(xué)特征以及現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)均表明其表達(dá)體系是一個(gè)極具潛力的植物表達(dá)體系,在生物反應(yīng)器領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。因此,浮萍生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)受到越來(lái)多的研究者的青睞,而浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究、植物表達(dá)系統(tǒng)所需的功能元件的挖掘和篩選鑒定等工作,就成了浮萍生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)的核心問(wèn)題?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物遺傳轉(zhuǎn)化操作通常需要較長(zhǎng)的周期,這也是浮萍生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)的主要限速步驟。而浮萍的瞬時(shí)表達(dá)體系正適合浮萍生物反應(yīng)器的快速研究,包括對(duì)功能元件的挖掘和篩選以及植物表達(dá)體系的優(yōu)化等。然而,目前尚未見(jiàn)關(guān)于浮萍瞬時(shí)表達(dá)體系研究的報(bào)道。傳統(tǒng)的植物原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系是利用電轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化等方式將外源基因?qū)朐|(zhì)體,經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)即可。但是,在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)浮萍原生質(zhì)體比較脆弱,難以經(jīng)受轉(zhuǎn)化及較長(zhǎng)時(shí)間的放置,故選擇以農(nóng)桿菌浸染愈傷作為外源基因轉(zhuǎn)入方式,再將轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備原生質(zhì)體。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此,本研究擬通過(guò)優(yōu)化調(diào)整農(nóng)桿菌浸染和浮萍原生質(zhì)體制備的相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù),建立浮萍瞬時(shí)表達(dá)體系,并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行初步探索,為浮萍生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        浮萍Lemnagibba愈傷組織、載體pCAMBIA2300-GFP和pCAMBIA2301-U啟-GFP均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所;載體pCAMBIA2301和pCAMBIA2301-N啟-GFP由四川維度創(chuàng)研生物科技有限公司提供;農(nóng)桿菌GV3101、LBA4404、C58C1及EHA105購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司。

        1.2 試劑

        MgCl2、CaCl2、KCl2。MES、甘露醇、BSA購(gòu)自sigma;果膠酶(Pectolyase Y-23)、纖維素酶(Cellulase R-10)和離析酶(Macerozyme R-10)購(gòu)自Yakult;pMDTM19-T Vector Cloning Kit、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、TaKaRa ExTaq?、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TAKARA;T4DNA ligase、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo Fisher;Eastep?Super Total RNA Extraction Kit購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

        1.3 方法

        1.3.1 擬南芥基因擴(kuò)增 提取擬南芥總RNA(Eastep?Super Total RNA Extraction Kit)利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲取cDNA(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit),然后以其為模板,分別擴(kuò)增基因AT3G10030.1(Aspartate/glutamate/uridylate kinase family protein)和AT2G26800.2(Aldolase superfamily protein)(表1)?;駻T4G16410.1(Transmembrane protein)直接合成N端198 bp,并在兩端分別添加EcoRⅠ和BglⅡ。

        1.3.2 載體構(gòu)建 將載體pCAMBIA2301用XhoⅠ酶切后自連,構(gòu)成載體pCAMBIA2301-a。再以載體pCAMBIA2300-GFP為模板,依次用上游引物MCS-gfp3、MCS-gfp2、MCS-gfp1與下游引物YS009搭配,采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增帶有多克隆位點(diǎn)的GFP(Green Fluorescent Protein )序列,并將其連接到pCAMBIA2301-a之中,替換原GUS基因,構(gòu)成載體pCAMBIA2301-GFP-MCS。最后將該載體用PvuⅡ酶切后自連,構(gòu)成載體pCAMBIA2301-GFP。

        將擬南芥基因AT3G10030.1經(jīng)NcoⅠ和BamHⅠ插入載體pCAMBIA2301-GFP,融合于GFP的N端,構(gòu)成載體pCAMBIA2301-C-GFP(用于胞質(zhì)定位研究);將擬南芥基因AT2G26800.2經(jīng)NcoⅠ和BglⅡ插入載體pCAMBIA2301-GFP,融合于GFP的N端,構(gòu)成載體pCAMBIA2301-M-GFP(用于膜定位研究);將擬南芥基因AT4G16410.1經(jīng)EcoRⅠ和BglⅡ插入載體pCAMBIA2301-GFP,融合于GFP的N端,構(gòu)成載體pCAMBIA2301-CH-GFP(用于葉綠體定位研究)。

        表1 引物信息

        圖1 植物載體Fig.1 Representation of plant-compatible vectors

        1.3.3 原生質(zhì)體產(chǎn)率測(cè)定 將潔凈的血球計(jì)數(shù)板覆上蓋玻片,取原生質(zhì)體溶液滴入血球計(jì)數(shù)板與載玻片的縫隙,待液體充滿(mǎn)計(jì)數(shù)室后,在顯微鏡下觀(guān)察并記錄計(jì)數(shù)室的原生質(zhì)體數(shù)量,重復(fù)3次。

        原生質(zhì)體產(chǎn)率(個(gè)/g)=計(jì)數(shù)室原生質(zhì)數(shù)量×稀釋倍數(shù)×10 000(個(gè)/mL)×體積(mL)/初始質(zhì)量(g)

        1.3.4 原生質(zhì)體活性測(cè)定 制備原生質(zhì)體單細(xì)胞懸液,按2∶1的比例加入FDA染液[4]染色1~2 min,取少量于載玻片上觀(guān)察,發(fā)熒光者即為活細(xì)胞。

        熒光顯微鏡觀(guān)察方法:采用450~490 nm激發(fā)濾片,510 nm雙分色鏡和520 nm阻擋濾片的FITC濾片組進(jìn)行觀(guān)察并記數(shù),重復(fù)3次。

        細(xì)胞活率(%)= 活細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100

        1.3.5 浮萍原生質(zhì)體制備參數(shù)優(yōu)化 本研究采用酶解法制備浮萍原生質(zhì)體,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-9]及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,酶解液為2 %纖維素酶、0.5 %離析酶、0.5 %果膠酶、20 mmol/L MES、0.5 mol/L甘露醇、20 mmol/L KCl、10 mmol/L CaCl2、0.1 % BSA、pH 5.8。分別對(duì)制備材料類(lèi)型、預(yù)處理方法、滲透壓濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

        其中,材料類(lèi)型分別為綠色致密型愈傷(Lemnagibba愈傷誘導(dǎo)時(shí),葉片卷曲膨大,最早出現(xiàn)的綠色顆粒狀愈傷組織)、黃色松散型愈傷(綠色致密型愈傷繼續(xù)培養(yǎng)后,出現(xiàn)的黃色松散似沙狀的愈傷組織)和懸浮培養(yǎng)愈傷(利用黃色松散型愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng),待其愈傷顆粒大小約3 mm即可);滲透壓濃度為0.2~0.7 mol/L的甘露醇;預(yù)處理方法分別為未處理、暗處理(暗培養(yǎng)16 h)、冷處理(4 ℃放置16 h)、高滲處理(0.6 mol/L甘露醇浸泡30 min)、復(fù)合處理Ⅰ(暗培養(yǎng)16 h,再用0.6 mol/L甘露醇浸泡30 min)、復(fù)合處理Ⅱ(4 ℃放置16 h,再用0.6 mol/L甘露醇浸泡30 min)。

        制備方法:取制備材料0.2 g,加入2 mL酶解液,置于26 ℃環(huán)境中避光振蕩(40 r/min)孵育12 h。加入2 mL W5溶液[8]輕柔混勻,經(jīng)200目鋼絲網(wǎng)過(guò)濾,1000 r/min離心3 min,小心去掉上清,用200 μl MMG溶液(4 mmol/L MES、0.5 mol/L甘露醇、15 mmol/L MgCl2、pH 5.8)輕輕重懸細(xì)胞。各組試驗(yàn)均重復(fù)3次,統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)率和活性。

        1.3.6 農(nóng)桿菌浸染參數(shù)優(yōu)化 本研究分別對(duì)農(nóng)桿菌類(lèi)型、菌液濃度、乙酰丁香酮濃度及共培養(yǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。除試驗(yàn)因素外,其余因素參照下述浸染方法。

        浸染方法:①將農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600約為1,于3000 r/min離心10 min收集菌體,用等量B5培養(yǎng)基(含100 μmol/L乙酰丁香酮)重懸菌體即為浸染液。②選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的懸浮培養(yǎng)愈傷組織1 g(鮮重),加入10 mL浸染液,靜置20 min,吸干菌液。③將浸染后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到鋪墊有濾紙的培養(yǎng)皿中,加入2~3 mL B5培養(yǎng)基(含100 μmol/L乙酰丁香酮),保持濾紙和愈傷組織濕潤(rùn),于28 ℃暗培養(yǎng)2 d。④用清水沖洗愈傷組織去除殘留農(nóng)桿菌,制備原生質(zhì)體并用熒光顯微鏡觀(guān)察。取50 μl原生質(zhì)體溶液統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率,并重復(fù)3次。

        轉(zhuǎn)化率(%)=發(fā)光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100

        1.3.7 浮萍原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]選擇定位于細(xì)胞膜(AT2G26800.2)、細(xì)胞質(zhì)(AT3G10030.1)和葉綠體(AT4G16410.1)的擬南芥基因,分別與GFP構(gòu)成融合表達(dá)載體,利用浮萍瞬時(shí)表達(dá)體系進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),通過(guò)共聚焦顯微鏡(Leica TCS-sp8)觀(guān)察其在浮萍細(xì)胞中的定位情況。

        GFP觀(guān)察的激光參數(shù):激發(fā)光488 nm,發(fā)射光:505~530 nm;葉綠體自發(fā)光的激光參數(shù):激發(fā)光488 nm,發(fā)射光600~750 nm。

        1.3.8 啟動(dòng)子功能檢測(cè) 選取3個(gè)用于植物細(xì)胞蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子:35 S啟動(dòng)子、N啟動(dòng)子、U啟動(dòng)子。以GFP作為報(bào)告基因,利用浮萍原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),并用熒光顯微鏡(Nikon Ti-E)觀(guān)察GFP表達(dá)情況。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)500個(gè)發(fā)光細(xì)胞的累積光密度,并用NORMDIST函數(shù)分析其分布情況。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 材料類(lèi)型對(duì)原生質(zhì)體制備產(chǎn)率和活性的影響

        浮萍Lemnagibba制備原生質(zhì)體時(shí),不同類(lèi)型的愈傷組織制備原生質(zhì)體的產(chǎn)率差異極顯著,而活性差異卻不顯著(表2)。其中,以懸浮培養(yǎng)的愈傷組織制備原生質(zhì)體的產(chǎn)率最高,故以其作為制備原生質(zhì)體的材料。

        2.2 滲透壓濃度對(duì)原生質(zhì)體制備產(chǎn)率和活性的影響

        滲透壓濃度對(duì)浮萍Lemnagibba原生質(zhì)體制備的影響主要在產(chǎn)率方面。當(dāng)甘露醇濃度在0.2~0.6 mol/L時(shí),原生質(zhì)體的活性差異不顯著,但濃度上升到0.7 mol/L時(shí),活性下降極顯著。隨著滲透壓的增加,原生質(zhì)體的產(chǎn)率先增后減,當(dāng)甘露醇濃度為0.5 mol/L時(shí),產(chǎn)率達(dá)到最高水平,且與其他濃度相比,差異達(dá)到極顯著水平(表3)。綜合考慮產(chǎn)率和活性情況,選擇滲透壓條件為0.5 mol/L甘露醇。

        2.3 預(yù)處理方法對(duì)原生質(zhì)體制備產(chǎn)率和活性的影響

        經(jīng)過(guò)冷處理的材料,其制備的原生質(zhì)體的活性相對(duì)較高,且差異顯著性達(dá)到極顯著水平。在原生質(zhì)體產(chǎn)率方面,冷處理僅低于暗處理,且差異不顯著,卻與其他處理方法的差異顯著(表4),故選擇冷處理作為預(yù)處理的方法。綜合上述試驗(yàn),浮萍Lemnagibba的懸浮培養(yǎng)愈傷組織(圖2-a),可以用酶解法來(lái)制備原生質(zhì)體(圖2-b),并可用FDA染色來(lái)檢測(cè)活性情況(圖2-c)。

        2.4 農(nóng)桿菌浸染參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

        本研究所選的4種農(nóng)桿菌,在浸染浮萍Lemnagibba愈傷組織時(shí),其轉(zhuǎn)化率的差異極大,其中GV3101轉(zhuǎn)化率最高(圖3-a)。轉(zhuǎn)化率隨著農(nóng)桿菌GV3101濃度的增加,呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)其濃度(OD600)為1時(shí),轉(zhuǎn)化率最高(圖3-b)。而乙酰丁香酮濃度為100 μmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化率最高,過(guò)高和過(guò)低的乙酰丁香酮都會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率(圖3-c)。在缺乏乙酰丁香酮時(shí),未能成功轉(zhuǎn)化,可見(jiàn)其對(duì)于浮萍Lemnagibba是必須的。另外,在一定時(shí)間內(nèi),增加共培養(yǎng)的時(shí)間有利于農(nóng)桿菌浸染更加充分,進(jìn)而增加轉(zhuǎn)化率。當(dāng)共培養(yǎng)2~3 d時(shí),具有最高的轉(zhuǎn)化率,而隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率又開(kāi)始下降,這可能是由于愈傷生長(zhǎng)狀態(tài)下降所致(圖3-d)。因此,兼顧轉(zhuǎn)化率和實(shí)驗(yàn)周期,共培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

        表2 不同材料制備原生質(zhì)體活性和產(chǎn)率的差異顯著性(LSD法)

        表3 不同滲透壓條件制備原生質(zhì)體產(chǎn)率和活性的差異顯著性(LSD法)

        表4 不同預(yù)處理?xiàng)l件制備原生質(zhì)體活性和產(chǎn)率的差異顯著性(LSD法)

        a:懸浮培養(yǎng)愈傷組織;b:原生質(zhì)體;c:原生質(zhì)體FDA染色(發(fā)光者皆為活細(xì)胞)圖2 原生質(zhì)體制備及活性測(cè)定Fig.2 Preparation and activity determination of protoplasm

        圖3 農(nóng)桿菌浸染參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The impacts of conditions of agrobacterium tumester on transformation rate

        2.5 亞細(xì)胞定位

        本研究共選擇3個(gè)已知定位信息的擬南芥基因,并以GFP作為報(bào)告基因。其共聚焦顯微鏡觀(guān)察結(jié)果(圖4)顯示,GFP基因單獨(dú)表達(dá)時(shí),其熒光分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。擬南芥基因AT3G10030.1與GFP融合表達(dá)時(shí),熒光分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì),與其在擬南芥細(xì)胞中定位情況一致[10]。擬南芥基因AT2G26800.2與GFP融合表達(dá)時(shí),熒光主要分布于細(xì)胞膜,與其在擬南芥細(xì)胞中定位基本一致[10]。擬南芥基因AT4G16410.1與GFP融合表達(dá)時(shí),熒光分布位置與葉綠體自發(fā)光位置一致,與其在擬南芥中的分布情況基本一致[11]。上述結(jié)果表明,該瞬時(shí)表達(dá)體系可以用來(lái)研究目的蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

        C:細(xì)胞質(zhì) M:細(xì)胞膜 CH:葉綠體 ;*標(biāo)尺:10 μm圖4 亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.4 The results of subcellular localization

        2.6 啟動(dòng)子功能檢測(cè)

        本研究選取3個(gè)植物啟動(dòng)子分別與GFP構(gòu)建融合表達(dá)載體,并利用浮萍原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明,不同啟動(dòng)子的發(fā)光強(qiáng)度有所差異(圖5-a),且同一表達(dá)載體在不同細(xì)胞中的表達(dá)情況也不相同。對(duì)500個(gè)發(fā)光細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)分析,3個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)GFP累計(jì)光密度分布顯示:U啟動(dòng)子累積光密度的總體平均數(shù)最大(49.60),N啟動(dòng)子次之(43.13),35S啟動(dòng)子最小(18.65);而離散度則是N啟動(dòng)子最大,U啟動(dòng)子次之,35S啟動(dòng)子最小(圖5-b)。

        3 討 論

        植物原生質(zhì)體制備的方法包括機(jī)械法、滲透壓法和酶解法,酶解法是目前最常用的方法,其中常用的酶有纖維素酶、離析酶、果膠酶、半纖維素酶和崩潰酶等[12]。本研究采用纖維素酶、離析酶和果膠酶制備浮萍的原生質(zhì)體,經(jīng)過(guò)對(duì)原生質(zhì)體制備材料、預(yù)處理方法、滲透壓濃度等一系列參數(shù)的優(yōu)化,確定了浮萍Lemnagibba原生質(zhì)體制備的最佳方案:以4 ℃過(guò)夜培養(yǎng)的浮萍懸浮培養(yǎng)愈傷組織為制備材料,用酶液(2 %纖維素酶、0.5 %離析酶、0.5 %果膠酶、0.1 mol/L CaCl2、0.2 mol/L KCl、1 % BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25 ℃避光消化16 h(40 r/min)。

        a:不同熒光強(qiáng)度的原生質(zhì)體細(xì)胞;b:不同發(fā)光細(xì)胞的累積光密度分布情況圖5 GFP發(fā)光情況及其累積光密度分布情況Fig.5 GFP luminescence and its cumulative optical density distribution

        農(nóng)桿菌浸染浮萍Lemnagibba愈傷組織的效率受到諸多因素的影響,包括愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)、農(nóng)桿菌的類(lèi)型及濃度、乙酰丁香酮濃度和共培養(yǎng)的時(shí)間等[13]。其中農(nóng)桿菌的類(lèi)型影響極大,GV3101在OD600≈1、乙酰丁香酮100 μmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化效率最佳。此外,愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)也很重要,但難以對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確的界定,需要一定的經(jīng)驗(yàn)積累。而共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)可以增加農(nóng)桿菌持續(xù)浸染時(shí)間,但也會(huì)逐漸降低愈傷組織活性。

        蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究有助于探索其生理功能,是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要方法,也常用于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)信息的驗(yàn)證[14]。而GFP以其極好的靈敏性和無(wú)細(xì)胞毒性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)活體的實(shí)時(shí)觀(guān)察,被廣泛用作定位研究的報(bào)告基因[15]。本研究將擬南芥中已知定位信息的基因,與GFP構(gòu)建融合表達(dá)載體,利用浮萍原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),證明該體系可以用于亞細(xì)胞定位研究。這為浮萍基因的亞細(xì)胞定位研究奠定了基礎(chǔ),可以在一定程度上避免使用擬南芥等模式植物進(jìn)行研究的物種差異[16]。

        高效的表達(dá)載體是生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)和利用不可或缺的,而啟動(dòng)子則是一個(gè)高效表達(dá)載體所必須的核心元件??焖贉?zhǔn)確地檢測(cè)啟動(dòng)子的功能,方能為構(gòu)建高效的表達(dá)載體提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。通常而言,需經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作獲取轉(zhuǎn)基因植株,再通過(guò)分析目的基因表達(dá)情況來(lái)評(píng)估啟動(dòng)子的功能,這樣獲得的結(jié)果雖最為準(zhǔn)確,但卻需要耗費(fèi)長(zhǎng)達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年時(shí)間,且難以實(shí)現(xiàn)高通量。利用浮萍Lemnagibba瞬時(shí)表達(dá)體系,可以快速地檢測(cè)載體的表達(dá)情況,從而評(píng)估包括啟動(dòng)子在內(nèi)的表達(dá)載體功能元件的功能。然而,該瞬時(shí)表達(dá)體系對(duì)于組織特異性啟動(dòng)子功能的驗(yàn)證還存在不足,需要更加深入的研究。另外,該瞬時(shí)表達(dá)體系不僅耗時(shí)短,大約3~4 d,還可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè),大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。本研究選擇的3個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)GFP的熒光強(qiáng)度存在差異,主要表現(xiàn)在總體平均數(shù)、離散度等方面,證明該方法可用于驗(yàn)證啟動(dòng)子功能。但是,該結(jié)果并不界定啟動(dòng)子的強(qiáng)弱,僅展示其熒光強(qiáng)度的分布情況。故,在具體的研究中,應(yīng)根據(jù)研究目的不同,以總體平均數(shù)或離散度作為標(biāo)準(zhǔn),選擇恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子。

        與模式植物擬南芥的原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系相比,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浮萍Lemnagibba瞬時(shí)表達(dá)體系還存在一定的差距,主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)化率上,尚不足擬南芥的十分之一。該體系較低的轉(zhuǎn)化率也大大增加了工作量,還限制了該體系的應(yīng)用領(lǐng)域。然而植物原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化是極為復(fù)雜的,本研究還有一些技術(shù)障礙未能突破,需要更加深入的探索。在植物原生質(zhì)體制備過(guò)程中,常用產(chǎn)率和活性來(lái)評(píng)估其制備方法,但用這種評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)制備出的原生質(zhì)體可能并不是最適合轉(zhuǎn)化的,這也是值得探索的方面。隨著研究的深入,浮萍原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系可更加高效、穩(wěn)定,為浮萍生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)提供助力。

        4 結(jié) 論

        成功建立浮萍原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系,可以在短時(shí)間內(nèi)完成亞細(xì)胞定位研究和啟動(dòng)子功能驗(yàn)證。

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