姚興蘭,王磊,張?zhí)m

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

維生素E(vitamin E)是一類(lèi)脂溶性化合物的總稱，是人類(lèi)和動(dòng)物自身不能合成、只能從外界攝取的重要維生素。維生素E對(duì)植物也具有非常重要的生物學(xué)功能，如清除活性氧、維護(hù)生物膜的穩(wěn)定、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、提高植物對(duì)非生物逆境的適應(yīng)性等[1-4]。維生素E包括生育酚(tocopherol)和三烯生育酚(tocotrienol)。天然維生素E由8種同系物組成，根據(jù)其疏水植基側(cè)鏈的飽和程度以及芳香環(huán)頭部所含的甲基的位置和數(shù)量，分為α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-三烯生育酚，其中以α-生育酚的活性為最高[5]。維生素E只能在光合組織(植物和光合細(xì)菌)中合成，生育酚廣泛分布在植物的葉片、雙子葉植物的種子以及單子葉植物的胚中，植物油和堅(jiān)果中含量豐富；三烯生育酚則主要存在于大多數(shù)單子葉植物的胚乳中[6]。盡管維生素E分布廣泛，但營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，大部分人群的維生素E攝入量并未達(dá)到推薦用量，仍處于維生素E慢性缺乏狀態(tài)[7-8]。作為動(dòng)物飼料主要原料的玉米，其種子中維生素E的含量較低，且主要組分是活性較低的γ-生育酚，因此，動(dòng)物飼料中要大量添加外源合成的DL-α-生育酚醋酸酯來(lái)滿足動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求。然而DL-α-生育酚醋酸酯的活性和生物利用率是天然維生素E的2/3和1/7～1/5[9-10]，大大增加了飼料成本[11]。因此，提高植物中尤其是作物中天然維生素E的含量是解決“隱性饑餓”問(wèn)題的重要途徑。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，維生素E的合成途徑已逐漸清晰，對(duì)植物中的維生素E進(jìn)行生物強(qiáng)化研究也已經(jīng)成為可能。本文將從維生素E的合成途徑入手，綜述植物中維生素E的生物強(qiáng)化研究進(jìn)展，并從遺傳的角度探討維生素E合成仍需解決的問(wèn)題以及今后維生素E生物強(qiáng)化的思路。

1 維生素E的合成途徑

維生素E是一類(lèi)含有芳香環(huán)頭部和植基側(cè)鏈的兩性分子，其生物合成途徑在質(zhì)體中完成，主要涉及兩條代謝通路合成維生素E的前體物質(zhì)。提供芳香環(huán)頭部的尿黑酸(homogentisate, HGA)來(lái)自于胞質(zhì)莽草酸途徑(shikimate pathway)中的4-羥基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate，HPP)，HPP雙加氧酶(p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD)催化HPP生成HGA。植物中，HPP來(lái)自于酪氨酸(tyrosine, Tyr)的降解，酪氨酸在酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrosine aminotransferase，TAT)的作用下生成HPP；藍(lán)細(xì)菌中，HPP則是分支酸/預(yù)苯酸(chorismate/prephenate)經(jīng)由分支酸/預(yù)苯酸脫氫酶(chorismate/prephenate dehydrogenase，TyrA)的作用而來(lái)。牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl-pyrophosphate, GGPP)來(lái)自于非甲羥戊酸途徑(MEP pathway)[6]，GGPP合成酶GGPPS11(GGPP synthase)催化質(zhì)體中GGPP的合成[12]；植基焦磷酸(phytyl-pyrophosphate, PPP)一方面由GGPP經(jīng)GGPP還原酶(GGPP ruductase，GGR)還原得來(lái)[13]，另一方面由葉綠素降解產(chǎn)物植醇(phytol)經(jīng)過(guò)兩步磷酸化[植基激酶VTE5 (phytol kinase)和植基單磷酸激酶VTE6 (phytyl-p kinase)]生成PPP[14-15]。

前體物質(zhì)生成以后，開(kāi)始維生素E的核心合成途徑。生育酚生物合成的起始步驟是HGA和PPP在尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(homogentisate phytyltransferase, HPT/VTE2)的催化下縮合形成2-甲基-6-植基苯醌(2-methyl-6-phytylbenzoquinol, MPBQ)。三烯生育酚的生物合成是HGA和GGPP在尿黑酸牻牛兒牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶(homogentisate geranylgeranyl-transferase, HGGT)的催化下縮合生成2-甲基-6-牻牛兒牻牛兒基苯醌(2-methyl-6-geranylgeranylbenzoquinol,MGGBQ)。MPBQ和MGGBP在2-甲基-6-植基苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶(MPBQ methyltransferase, MPBQ MT/VTE3)的作用下分別生成2,3-二甲基-5-植基苯醌(2, 3-dimethyl-5-phytylbenzoquinol, DMPBQ)和2,3-二甲基-5-牻牛兒牻牛兒基苯醌(2, 3-dimethyl-5-geranylgeranylbenzoquinol, DMGGBQ)。之后，MPBQ、DMPBQ、MGGBQ、DMGGBQ在生育酚環(huán)化酶(tocopherol cyclase, TC/VTE1)的作用下分別生成δ-生育酚、γ-生育酚、δ-三烯生育酚和γ-三烯生育酚，然后再在γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-tocopherol methyltransferase, γ-TMT/VTE4)的作用下生成β-生育酚、α-生育酚、β-三烯生育酚和α-三烯生育酚(圖1)[16-17]。

2 維生素E的生物強(qiáng)化

由于維生素E的重要性以及維生素E合成途徑的日漸清晰，人們已經(jīng)針對(duì)維生素E合成途徑關(guān)鍵酶基因開(kāi)展了生物強(qiáng)化工作，總體上有兩種策略：一是提高維生素E的總含量，主要通過(guò)提高維生素E合成前體物質(zhì)HGA、PPP和GGPP的含量以及提高維生素E合成起始步驟的關(guān)鍵酶基因HPT和HGGT的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)；二是改變維生素E各組分的比例，將低活性的組分轉(zhuǎn)化為高活性的組分，尤其是提高高活性α-生育酚的含量，主要是通過(guò)提高γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT)的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.1 提高維生素E的總含量

2.1.1提高維生素E合成前體物質(zhì)的含量 研究人員對(duì)維生素E的前體物質(zhì)進(jìn)行了外源添加實(shí)驗(yàn)，以此來(lái)驗(yàn)證前體物質(zhì)的含量是否是維生素E的合成限制因子。向日葵的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中添加HGA，生育酚的含量提高了30%左右，而添加植醇則無(wú)任何影響[18]。紅花細(xì)胞培養(yǎng)物中添加植醇培養(yǎng)3 d后，生育酚含量得到了顯著提高，而添加HGA則無(wú)影響；培養(yǎng)至14 d時(shí)，添加HGA的細(xì)胞培養(yǎng)物生育酚含量提高了約3.3倍，而添加植醇的細(xì)胞培養(yǎng)物生育酚含量提高了18.4倍[19]。大豆的懸浮培養(yǎng)物中分別添加HGA和植醇，生育酚含量均提高了2倍；而同時(shí)添加HGA和植醇，生育酚含量則提高了5倍[20]。這些結(jié)果表明，前體物質(zhì)的含量確實(shí)對(duì)生育酚的合成具有限制作用，通過(guò)提高維生素E合成前體物質(zhì)的含量可以改善維生素E的合成。但對(duì)于不同的植物材料來(lái)說(shuō)，不同的前體物質(zhì)的限制作用不同。

注：δ-T3—— δ-三烯生育酚; γ-T3——γ-三烯生育酚; β-T3——β-三烯生育酚; α-T3——α-三烯生育酚; δ-T——δ-生育酚; γ-T——γ-生育酚; β-T——β-生育酚; α-T——α-生育酚; CHLSYN——葉綠素合成酶; GG Chl——牻牛兒牻牛兒基葉綠素; phy Chl——植基葉綠素; GA3P——3-磷酸甘油醛; pyruvate——丙酮酸; DXS——脫氧木糖-5-磷酸合酶; DXR——脫氧木糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶; CHLase——葉綠素酶; HGO——HGA雙加氧酶;MAA——4-馬來(lái)酰乙酰乙酸。圖1 維生素E合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathway of vitamin E

①提高HGA的有效性。HGA是生育酚和三烯生育酚合成的共同前體物質(zhì)，因此，HGA對(duì)于維生素E的合成也更為關(guān)鍵。過(guò)表達(dá)HGA合成的關(guān)鍵酶基因HPPD，轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草和大豆中的維生素E含量均未得到大幅提高[20-24]；而在藍(lán)細(xì)菌中過(guò)表達(dá)HPPD，生育酚含量則提高了7倍[20]。分析原因主要是由于植物和細(xì)菌中HGA的前體物質(zhì)HPP合成途徑的差異造成的。細(xì)菌中的預(yù)苯酸脫氫酶TyrA可以直接催化預(yù)苯酸生成HPP；而植物中從預(yù)苯酸到HPP則步驟復(fù)雜，并且中間產(chǎn)物Tyr通過(guò)反饋抑制TyrA來(lái)嚴(yán)格控制HPP的生成，從而限制了HGA的合成，進(jìn)而限制維生素E的合成[25]。同時(shí)過(guò)表達(dá)HPPD和TyrA基因，轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草葉片中維生素E含量分別提高了2和10倍[22-23]，轉(zhuǎn)基因擬南芥、油菜和大豆種子中維生素E 含量分別提高到了1.8、2.4和2.6倍[20]。這些結(jié)果充分說(shuō)明，提高HGA的有效性促進(jìn)了維生素E的合成。但是，這些HGA含量提高的轉(zhuǎn)基因植株中，新合成的維生素E主要是三烯生育酚，表明HGA的有效性主要限制了三烯生育酚的合成，而HGA本身對(duì)生育酚合成的促進(jìn)作用似乎不大。

實(shí)際上，同時(shí)過(guò)表達(dá)HPPD和TyrA基因，轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆種子中HGA含量分別提高了60和800倍，導(dǎo)致種子顏色也變?yōu)榱俗厣梁谧厣?，但維生素E含量提高的并不多[20]，表明新合成的HGA中只有部分參與了維生素E的合成，推測(cè)還有其他途徑消耗HGA。Stacey等[26]最近發(fā)現(xiàn)了限制HGA有效性的新機(jī)制，他們?cè)诖蠖沟膍o12突變體中發(fā)現(xiàn)HGA雙加氧酶(HGO1)的缺失，導(dǎo)致HGA的積累量大幅提高，達(dá)到了野生型的30倍，而維生素E含量?jī)H提高為野生型的2倍。HGO1催化HGA降解生成4-馬萊酰乙酰乙酸(MAA)，表明HGO1是維生素E合成的限制因素之一。但是MO12突變體與上述HGA含量提高的轉(zhuǎn)基因植株一樣，維生素E含量的提高主要是三烯生育酚含量的變化，而生育酚含量并未發(fā)生改變，進(jìn)一步說(shuō)明HGA的有效性對(duì)生育酚的合成并不是充分條件。那么，是不是前體物質(zhì)PPP或者GGPP在維生素E的合成中起著更關(guān)鍵的作用呢？

②提高GGPP的有效性。GGPP是多種代謝物質(zhì)的植基側(cè)鏈的來(lái)源，如維生素E、類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)物質(zhì)、葉綠素、赤霉素、二萜等等。因此，GGPP的合成處于異戊二烯類(lèi)物質(zhì)合成的重要節(jié)點(diǎn)位置，提高GGPP合成途徑上游相關(guān)酶基因的表達(dá)有利于提高GGPP的有效性。過(guò)表達(dá)MEP途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因DXS，擬南芥幼苗中的生育酚含量提高了1倍左右，主要成分是α-生育酚[27]，表明DXS的高表達(dá)提高了GGPP的含量，進(jìn)而提高了PPP、生育酚的含量。但是，過(guò)表達(dá)DXS后，成熟植株葉片中的類(lèi)異戊二烯含量并無(wú)顯著變化，表明在擬南芥中DXS的活性可能只對(duì)幼嫩組織起作用[28]。過(guò)表達(dá)MEP途徑的第二個(gè)關(guān)鍵酶基因DXR后，并未獲得與DXS同樣的表型，可能DXR的底物D-5-磷酸脫氧木酮糖的含量是限制因素[29]。近些年研究報(bào)道了GGPP合成酶GGPPS在類(lèi)異戊二烯類(lèi)物質(zhì)合成中的重要性，Ruiz-Sola等[12]詳細(xì)研究了擬南芥的GGPPS，結(jié)果表明GGPPS11是大多數(shù)光合作用相關(guān)的異戊二烯類(lèi)化合物合成所必需的。

③提高PPP的有效性。PPP一方面來(lái)自于GGR對(duì)GGPP的還原，另一方面來(lái)自于葉綠素的降解(CHLase、VTE5、VTE6)。水稻中GGR1基因突變并未導(dǎo)致生育酚含量的降低，同時(shí)克隆并鑒定了GGR2，發(fā)現(xiàn)GGR2是生育酚合成所必須的[30]。擬南芥vte5突變體中，種子和葉片中生育酚含量分別降低了約80%和65%，在vte5突變體植株中過(guò)表達(dá)VTE5，生育酚含量幾乎恢復(fù)到了野生型的水平；在野生型植株中過(guò)表達(dá)VTE5，生育酚含量有少量提高[14]。轉(zhuǎn)VTE6基因后，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中生育酚含量提高了約15%[15]。

以上結(jié)果表明，提高維生素E合成前體物質(zhì)HGA對(duì)維生素E合成的影響較為明顯；而直接或者間接提高PPP和GGPP的含量，對(duì)維生素E含量的提高作用有限。

2.1.2提高HPT、HGGT等基因的表達(dá) HPT和HGGT分別催化HGA與PPP、HGA與GGPP的縮合，以及起始生育酚和三烯生育酚的合成，因此，HPT和HGGT基因是維生素E總含量強(qiáng)化的首選基因。

擬南芥AtHPT的過(guò)表達(dá)，使得擬南芥種子中的生育酚含量提高了2倍；而在大豆中過(guò)表達(dá)AtHPT或者SynechocystisHPT，大豆種子中生育酚含量提高了不足20%；油菜中過(guò)表達(dá)HPT基因，油菜種子中生育酚含量無(wú)顯著變化[20]。而通過(guò)過(guò)表達(dá)HPT基因，番茄和擬南芥葉片中的生育酚含量分別提高了3.6和4.4倍，主要組成成分是γ-生育酚[31-32]。這些結(jié)果表明，對(duì)于種子中生育酚的合成來(lái)說(shuō)，HPT的活性不是最主要的瓶頸，但HPT的活性確實(shí)限制了葉片中生育酚的合成。

在玉米中過(guò)表達(dá)大麥HGGT基因，轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中的維生素E含量提高了6倍，增加的主要成分是三烯生育酚，生育酚含量無(wú)變化[33-35]。在本身僅含有痕量三烯生育酚的大豆和亞麻薺中過(guò)表達(dá)大麥HGGT基因，轉(zhuǎn)基因材料種子中維生素E含量分別提高了10和6倍，而且增加的主要成分也是三烯生育酚[36]。煙草和擬南芥中過(guò)表達(dá)HGGT，葉片中的維生素E含量分別提高了15和5倍，仍然是大量積累了三烯生育酚[33,35]。Dolde等[34]分析了轉(zhuǎn)HGGT基因玉米籽粒以及提取的油中維生素E含量，發(fā)現(xiàn)籽粒中和油中三烯生育酚含量均提高了18倍，但生育酚含量出現(xiàn)了18%的降低；推測(cè)可能是生育酚和三烯生育酚的共同前體物質(zhì)HGA的含量起到了一定的限制作用，HGA可以滿足一定水平維生素E含量的提高，但限制了更高水平的提高；除此之外，這些數(shù)據(jù)也表明，HGGT的活性明顯限制了玉米籽粒中三烯生育酚的生物合成。截至目前，過(guò)表達(dá)HGGT被證明是提高維生素E含量最為有效的方法。

2.2 提高高活性α-生育酚的含量

γ-TMT催化低活性的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為高活性的α-生育酚。Shintani等[37]最早進(jìn)行了γ-TMT過(guò)表達(dá)研究，轉(zhuǎn)γ-TMT基因擬南芥種子中α-生育酚含量提高了80多倍，α-/γ-生育酚的比值從0.01升高到了13，推測(cè)是由于γ-TMT蛋白的活性低造成野生型擬南芥種子中的α-生育酚含量低。萵苣中過(guò)表達(dá)AtTMT基因，T2代轉(zhuǎn)基因株系中α-/γ-生育酚的比值從1.0升高到了138.0[38]。過(guò)表達(dá)擬南芥AtTMT基因和紫蘇的PfTMT基因，轉(zhuǎn)基因大豆種子中α-生育酚含量分別提高了4倍和10.4倍[39-40]。Zhang等[41-42]研究了大豆和玉米的γ-TMT基因，分別過(guò)表達(dá)GmTMT2a和ZmTMT基因，轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中90%以上的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為了高活性的α-生育酚。

過(guò)表達(dá)γ-TMT基因只能增加高活性的α-生育酚的含量，而不能改變生育酚的總含量。那么能否通過(guò)多基因共同表達(dá)來(lái)達(dá)到共同提高的目的呢？Van Eenennaam等[43]首先研究了MPBQMT基因，同樣不能改變生育酚的總含量，而是改變生育酚的組成，β-生育酚和δ-生育酚含量降低，大量積累α-生育酚和γ-生育酚；同時(shí)過(guò)表達(dá)γ-TMT基因和MPBQMT基因，轉(zhuǎn)基因大豆種子中α-生育酚含量提高了8倍，且種子中95%以上的生育酚組分為α-生育酚。過(guò)表達(dá)HPT基因和γ-TMT基因，既提高了總生育酚含量，也提高了α-生育酚的含量[31,43-44]。這也表明，通過(guò)多基因共同表達(dá)可以一定程度上達(dá)到生物強(qiáng)化的目的。

3 維生素E合成的遺傳解析

盡管人們對(duì)維生素E的合成途徑研究的比較清楚，也已經(jīng)利用維生素E合成途徑的關(guān)鍵酶基因開(kāi)展了生物強(qiáng)化相關(guān)工作，但是根據(jù)上面的論述，維生素E的生物強(qiáng)化只有在三烯生育酚含量提高以及維生素E組分之間的轉(zhuǎn)化方面效果較好，而生育酚總含量的生物強(qiáng)化并不盡如人意，這表明生育酚的合成代謝途徑可能還存在很多未知。另外，由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商業(yè)化還存在諸多限制，因此，也必須尋找更適合的方法來(lái)獲得維生素E含量高的作物品種。植物中維生素E含量存在豐富的自然變異；近些年，一些影響生育酚含量的基因被克隆[45-46]，也表明了生育酚合成的復(fù)雜性。研究人員通過(guò)數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative traits loci，QTL)、連鎖圖譜(linking mapping, LM)以及全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)等方法研究維生素E合成的遺傳特點(diǎn)，以期為維生素E的合成代謝以及生物強(qiáng)化提供新思路。

3.1 核心合成途徑中部分基因控制維生素E含量的自然變異

通過(guò)上述已有的研究可以看出，并不是維生素E合成途徑中的每一個(gè)酶都對(duì)維生素E的合成起關(guān)鍵作用，這一點(diǎn)通過(guò)對(duì)維生素E合成的遺傳基礎(chǔ)的研究得到了驗(yàn)證。Li等[47]對(duì)513份材料組成的關(guān)聯(lián)群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和連鎖分析，發(fā)現(xiàn)ZmTMT基因附近存在9個(gè)影響α-生育酚含量的SNP位點(diǎn)；重測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，位于ZmTMT基因5′-UTR區(qū)的InDel 7和位于啟動(dòng)子區(qū)的InDel 118顯著影響α-生育酚含量，同時(shí)也影響α-生育酚/γ-生育酚的比值，表明ZmTMT基因是控制玉米α-生育酚含量自然變異的有利基因。基于此開(kāi)發(fā)了分子標(biāo)記，為進(jìn)行高生育酚含量的玉米分子標(biāo)記輔助育種提供了便利。Wang等[48]對(duì)137份水稻核心種質(zhì)進(jìn)行重測(cè)序，選取144萬(wàn)個(gè)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與α-生育酚含量相關(guān)的關(guān)聯(lián)信號(hào)，最終鑒定出13個(gè)候選基因，其中OsγTMT被確認(rèn)為是影響水稻核心種質(zhì)中α-生育酚含量的最主要的遺傳因子；而且OsγTMT啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸多態(tài)性也在一定程度上影響了α-生育酚的含量。Dwiyanti等[49]通過(guò)QTL分析，從大豆KAS品種中鑒定出γ-TMT3是提高α-生育酚含量的候選基因，并且γ-TMT3的表達(dá)水平直接與α-生育酚含量正相關(guān)。Lipka等[50]對(duì)281份玉米自交系維生素E總量、維生素E各組分含量以及比值等表型的相關(guān)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ZmTMT與α-生育酚含量之間存在一定的關(guān)聯(lián)，ZmHGGT1和預(yù)苯酸脫氫酶同系物也影響三烯生育酚的變異。Diepenbrock等[45]通過(guò)對(duì)美國(guó)玉米NAM(nested association mapping)群體的GWAS分析，發(fā)現(xiàn)核心合成途徑中HGGT1、MPBQMT和γ-TMT與維生素E含量具有顯著相關(guān)關(guān)系。

綜合上述結(jié)果，維生素E含量的自然變異主要受到了HGGT1和γ-TMT基因的控制，也進(jìn)一步解釋了基因工程中三烯生育酚含量提高和維生素E各組分之間的轉(zhuǎn)化效果較好的原因；同時(shí)也暗示，維生素E的合成還受到非核心合成途徑中其他基因或者遺傳因子調(diào)控。

3.2 葉綠素合成代謝以及脂肪酸代謝相關(guān)基因調(diào)控維生素E的合成

已有一些研究表明，葉綠素合成代謝相關(guān)基因能夠調(diào)控維生素E的合成。Zhang等[16]研究葉綠素合酶的T-DNA突變體(chlsyn1-1)時(shí)發(fā)現(xiàn)，葉綠素合酶基因突變后，植株中葉綠素缺乏，生育酚含量?jī)H為野生型植株的10%，而且脂肪酸含量為野生型的50%，表明維生素E的合成與葉綠素合酶的活性具有很強(qiáng)的相關(guān)性。擬南芥vte5突變體中，種子和葉片中生育酚含量分別降低了約80%和65%[14]。這些都表明葉綠素合酶的突變，能夠?qū)е氯~綠素降解量減少，使得維生素E合成前體物質(zhì)PPP的合成降低；同樣，vte5突變后也影響了PPP的合成，因此，最終影響了生育酚的合成。不過(guò)，擬南芥和油菜等種子成熟前是綠色的，其種子中生育酚的合成與葉綠素合成代謝相關(guān)性很容易理解，那么非綠色種子中也富含維生素E就比較難解釋。人們推測(cè)可能非綠色種子中的GGR活性更高，使得GGPP更有效地轉(zhuǎn)化為PPP。但是，過(guò)表達(dá)HPT又不能很好的提高生育酚的含量，表明這種推測(cè)并不準(zhǔn)確。后來(lái)Diepenbrock等[45]的研究回答了這個(gè)問(wèn)題。他們通過(guò)對(duì)美國(guó)玉米NAM群體進(jìn)行研究，鑒定出了與維生素E合成相關(guān)的52個(gè)QTL和14個(gè)基因(8個(gè)已知基因和6個(gè)新基因)，其中2個(gè)新基因?yàn)槿~綠素合成酶編碼基因，能解釋生育酚的大部分變異。至此，對(duì)非綠色種子中富含維生素E的現(xiàn)象給出了強(qiáng)有力的證據(jù)。

另一些研究表明，脂肪酸代謝相關(guān)基因也能夠調(diào)控維生素E的合成。Wang等[17]為了解析維生素E合成的遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)RIL群體進(jìn)行了連鎖作圖分析，獲得了41個(gè)QTL；同時(shí)利用GWAS分析獲得的32個(gè)顯著位點(diǎn)中有18個(gè)與QTL共定位；并且對(duì)主效QTL精細(xì)定位驗(yàn)證了GWAS的準(zhǔn)確性以及QTL作圖的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)生育酚含量變異與脂肪酸途徑的5個(gè)基因關(guān)聯(lián)，脂肪酸代謝相關(guān)酶基因LACS的突變改變了生育酚的組成，甘油酰基轉(zhuǎn)移酶DGAT也影響了生育酚的含量。擬南芥HPT突變體在低溫下表現(xiàn)出了與野生型不同的脂肪酸組成，18碳三烯酸(18∶3)含量降低，而18碳二烯酸(18∶2)含量增加，表明生育酚合成影響了脂肪酸的合成代謝[51]；vte5突變體中，不但生育酚含量受到影響，脂肪酸植基酯(FAPEs)的豐度和成分也發(fā)生了變化[52]，葉片中FAPEs的成分中亞油酸的含量至少比野生型提高了2倍[53]。綜合這些結(jié)果，表明生育酚合成與脂肪酸合成代謝之間存在著互相影響。

上述結(jié)果均表明，葉綠素合成代謝相關(guān)的酶直接影響維生素E的合成；而維生素E的合成直接或間接影響脂肪酸的合成代謝，反過(guò)來(lái)，脂肪酸的合成代謝也影響維生素E的合成。

4 展望

目前維生素E合成的研究主要集中在其合成途徑中關(guān)鍵酶基因的研究，關(guān)于維生素E合成相關(guān)的調(diào)控因子的報(bào)道幾乎處于空白。Li等[47]的研究中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與維生素E合成相關(guān)的SNP位點(diǎn)，分別位于1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子和1個(gè)PPR蛋白的內(nèi)含子區(qū)，但并未進(jìn)行深入研究。Diepenbrock等[45]研究發(fā)現(xiàn)了1個(gè)存在于QTL39的基因，該基因編碼1個(gè)具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，是影響α-三烯生育酚含量的eQTL。這些都表明維生素E的合成存在調(diào)控因子。

另外，維生素E合成的前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題也是今后研究的重點(diǎn)。HGA來(lái)自于莽草酸途徑Tyr的降解，Tyr在TAT的作用下轉(zhuǎn)化為HPP，然后再在HPPD的作用下生產(chǎn)HGA。最近的研究表明，TAT1定位于細(xì)胞質(zhì)[54]，而且HPPD也是定位在葉綠體或者細(xì)胞質(zhì)[54-55]，暗示HGA可能全部或者部分在細(xì)胞質(zhì)中合成，然后再由未知的轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)體中合成維生素E。在大豆中最新報(bào)道的HGA雙加氧酶(HGO)也定位在細(xì)胞質(zhì)中，這也意味著至少在大豆中存在有將HGA從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)體中進(jìn)行維生素E合成的機(jī)制[26]。

綜上所述，今后維生素E的生物強(qiáng)化仍需結(jié)合維生素E的合成途徑以及維生素E合成的遺傳結(jié)構(gòu)，把研究重點(diǎn)放在維生素E的調(diào)控以及前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)上，將更加有助于維生素E生物強(qiáng)化工作的開(kāi)展。