毛中臣 孫永 趙燕 陳卡佳 付志新 (開封市中心醫(yī)院神內重癥，河南 開封 475000)

神經(jīng)膠質瘤(膠質瘤)是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，占顱內原發(fā)腫瘤的50%，手術治療、放射治療、化學治療等是目前膠質瘤治療的主要途徑，隨著膠質瘤發(fā)病機制研究的不斷深入，尋找有效的靶基因治療膠質瘤是研究的重點〔1〕。Musashi-1參與細胞的自我更新和分化過程，其是一個進化極為保守的RNA結合蛋白。研究顯示Musashi-1可能是一種致癌基因，能夠刺激腫瘤細胞的生長，增加腫瘤細胞致瘤能力〔2〕。對結腸癌和肺腺癌的體外研究顯示，Musashi-1下調可以誘導腫瘤細胞的凋亡〔3～5〕。本實驗通過構建下調Musashi-1的膠質瘤細胞，探討其在膠質瘤細胞凋亡、侵襲等中的作用，為靶向Musashi-1治療膠質瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 膠質瘤細胞U251和U87為賽業(yè)(蘇州)生物公司產(chǎn)品。細胞于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

兔抗活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3抗體、兔抗基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體、兔抗波形蛋白(vimentin)抗體為美國R&D Systems公司產(chǎn)品；兔抗MMP-2抗體、兔抗上皮性鈣黏附素(E-cadherin)抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；Musashi-1 siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒載體由深圳中洪博元生物公司構建；Musashi-1為美國Abcam公司產(chǎn)品；Realtime PCR試劑為德國QIAGEN公司產(chǎn)品；Line Gene 9600 Plus熒光定量PCR檢測系統(tǒng)為杭州博日科技公司產(chǎn)品；Thermo Multiskan FC 酶標儀為美國Thermo產(chǎn)品；Biosciences FACSAria Ⅲ流式細胞儀為美國BD產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1慢病毒感染 膠質瘤細胞U251和U87培養(yǎng)至對數(shù)期以后，分別種植到6孔板中，細胞接種密度為5×105個/孔，細胞密度為40%時，進行感染。病毒感染復數(shù)(MOI)=20，向細胞中加入病毒液(病毒液滴度為1×108tu/ml)，同時在細胞中添加聚凝胺(polyberne)，polyberne終濃度為5 μg/ml。培養(yǎng)8 h后，觀察細胞生長狀態(tài)，把原來的培養(yǎng)液吸棄，加入新鮮的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，用1 μg/ml的嘌呤霉素篩選，篩選穩(wěn)定感染的細胞株用Realtime PCR和Western印跡檢測干擾效果。

1.2.2實驗分組 把感染Musashi-1 siRNA慢病毒后的細胞記為si-Musashi-1組，把感染陰性對照慢病毒后的細胞記為si-NC組。把沒有感染的細胞記為Control組。

1.2.3Realtime PCR測定干擾效果 Control組、si-NC組、si-Musashi-1組細胞中添加Trizol(每個25 mm2的培養(yǎng)瓶中加入1 ml的Trizol)，將細胞置于冰上混合裂解以后，在裂解液中添加200 μl三氯甲烷溶液，并置于室溫條件孵育3 min，在4℃，10 000 r/min離心10 min后，吸取上層溶液約500 μl(RNA存在上層水相中)。添加等體積的異丙醇后，放在4℃條件下結合孵育30 min。離心后，添加75%乙醇將沉淀的RNA洗滌后，在室溫中干燥，添加焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，保存至-70℃。按照逆轉錄合成試劑盒合成cDNA，設置逆轉錄條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s，4℃ 10 min。再進行Realtime PCR，PCR的程序為：95℃ 15 s；58℃ 60 s，一共40個循環(huán)。PCR結束后，用2-△△Ct方法計算目的基因Musashi-1的mRNA表達情況，以β-actin作為內參。引物由南京金斯瑞合成。Musashi-1的上游引物序列為5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′，下游引物序列為5′-GTAATACGGT TATCCACGCG-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游引物序列為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

1.2.4Western印跡測定干擾效果 向Control、si-NC、si-Musashi-1各組細胞中添加裂解液，并放置在冰上反應20 min，4℃，10 000 r/min高速離心。蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液中混合后，煮沸5 min。按照每個泳道加入40 μg蛋白樣品，濃縮膠中80 V電壓，分離膠中100 V電壓進行電泳。電泳結束后，進行轉膜，轉膜置于4℃中進行，轉膜電流設置為200 mA，轉膜時長為2 h。取出轉膜后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于封閉液(5%脫脂奶)中室溫孵育2 h，用TBST洗滌后，再將PVDF膜放在1∶200稀釋的抗Musashi-1抗體中室溫孵育2 h。PVDF膜經(jīng)TBST洗滌后，置于1∶5 000稀釋的Ⅱ抗中室溫結合2 h。用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒顯色以后，以軟件Image J分析灰度值，以每組的β-actin灰度值為內參，分析并計算Musashi-1/β-actin灰度值的比值，以此比值作為Musashi-1的蛋白表達水平。

1.2.5噻唑藍(MTT)檢測細胞活力 Control、si-NC、si-Musashi-1各組細胞用細胞培養(yǎng)液懸浮，制成濃度為4×104個/ml的單細胞懸浮液，每個孔中加入100 μl種植到96孔板內，把培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內，分別在24 h、48 h、72 h、96 h取出培養(yǎng)板，每組設置4個復孔，添加10 μl的MTT溶液(濃度為5 mg/ml)顯色以后，加入二甲基亞砜(DMSO)孵育10 min。置于酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測儀上檢測492 nm波長處的吸光度(A值)，以空白孔調零 。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 Control、si-NC、si-Musashi-1各組細胞用0.25%的胰蛋白酶常規(guī)消化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞懸浮，制成濃度為1×106個/ml的細胞懸浮液。吸取1 ml的細胞懸浮液至5 ml的培養(yǎng)管內，加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)染液，在避光條件下孵育15 min。添加400 μl的結合緩沖液混合以后，上流式細胞儀檢測。

1.2.7劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 Control、si-NC、si-Musashi-1各組細胞用0.25%的胰蛋白酶常規(guī)消化后，用細胞培養(yǎng)液將細胞懸浮，制成濃度為1×104個/ml的細胞懸浮液，種植到培養(yǎng)瓶中，細胞密度為80%時，在細胞中劃出一條劃痕，繼續(xù)置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別測定0 h和24 h時劃痕的寬度，計算細胞遷移率變化。細胞遷移率=100%×(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.2.8Transwell小室檢測細胞侵襲 基質膠濕化transwell小室2 h。Control、si-NC、si-Musashi-1各組細胞用不含血清的培養(yǎng)液懸浮以后，在上室中添加200 μl的細胞懸浮液(約含有105個細胞)，在下室內加入600 μl的含血清的細胞培養(yǎng)液。24 h后取出transwell小室，用棉簽將小室內沒有穿膜的細胞擦掉，4%多聚甲醛固定后，用結晶紫染色。顯微鏡下選取至少5個視野觀察細胞侵襲數(shù)目。

1.2.9Western印跡檢測細胞中cleaved caspase-3、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、vimentin蛋白水平 取Control、si-NC、si-Musashi-1各組細胞，用Western印跡方法檢測細胞中cleaved caspase-3(抗體以1∶100稀釋)、MMP-2(抗體以1∶400稀釋)、MMP-9(抗體以1∶400稀釋)、E-cadherin(抗體以1∶600稀釋)、vimentin(抗體以1∶600稀釋)蛋白水平，步驟同1.2.4。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1Musashi-1 siRNA慢病毒下調膠質瘤U251和U87細胞中Musashi-1的表達 膠質瘤U251和U87細胞感染Musashi-1 siRNA慢病毒后，細胞中的Musashi-1蛋白和mRNA水平均降低，說明成功構建了下調Musashi-1的膠質瘤細胞。見表1、圖1、圖2。

圖1 Western印跡檢測U251細胞Musashi-1蛋白表達

圖2 Western印跡檢測U87細胞Musashi-1蛋白表達

表1 下調Musashi-1后的膠質瘤細胞中Musashi-1 mRNA和蛋白表達水平比較

2.2下調Musashi-1降低膠質瘤U251和U87細胞活力 下調Musashi-1后的膠質瘤細胞A值明顯降低，說明下調Musashi-1降低膠質瘤細胞活力。見表2。

表2 敲減Musashi-1表達后膠質瘤U251和U87細胞A值的比較

2.3敲減Musashi-1表達誘導膠質瘤U251和U87細胞凋亡 敲減Musashi-1表達后膠質瘤細胞的凋亡率和細胞中cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，說明下調Musashi-1可在體外誘導膠質瘤細胞凋亡。見表3、圖3～5。

表3 下調Musashi-1后膠質瘤細胞凋亡率和cleaved caspase-3水平比較

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡

圖4 Western印跡檢測U251細胞cleaved caspase-3蛋白表達

圖5 Western印跡檢測U87細胞中cleaved caspase-3蛋白表達

2.4下調Musashi-1抑制膠質瘤U251和U87細胞侵襲和遷移 下調Musashi-1后的膠質瘤細胞侵襲數(shù)目及遷移率均顯著降低，膠質瘤細胞中的MMP-2和MMP-9蛋白表達均顯著減少(P<0.05)，說明下調Musashi-1抑制膠質瘤細胞侵襲和遷移能力。見表4、圖6、圖7。

表4 下調Musashi-1后膠質瘤U251和U87細胞遷移率、侵襲數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白水平比較

圖6 Western印跡檢測U251細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達

圖7 Western印跡檢測U87細胞中MMP-2、MMP-9蛋白

2.5下調Musashi-1抑制膠質瘤細胞上皮-間質轉化(EMT) 下調Musashi-1后的膠質瘤細胞中E-cadherin表達水平顯著升高，細胞中vimentin表達水平顯著下降(P<0.05)，說明下調Musashi-1抑制膠質瘤細胞EMT。見圖8、圖9、表5。

圖8 Western印跡檢測U251細胞E-cadherin、vimentin蛋白表達

圖9 Western印跡檢測U87細胞E-cadherin、vimentin蛋白表達

表5 下調Musashi-1后的膠質瘤細胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達水平比較

3 討 論

基因轉錄后調控與RNA結合蛋白有關，在人類的體內已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有800多種的RNA結合蛋白，在這些RNA結合蛋白中有的與轉錄因子功能相似，參與癌變過程，在腫瘤發(fā)生中具有促進或者抑制作用〔6〕。Musashi-1屬于RNA結合蛋白，具有維持自我更新和分化等的作用，是多種細胞的干細胞標志物，是結腸癌等多種癌癥發(fā)生的調節(jié)劑〔7〕。人類的Musashi-1基因含有兩個RNA結構域，這兩個結構域中含有α-螺旋和β折疊，能夠與目的RNA結合，參與基因的表達調控過程〔8〕。很多研究顯示，Musashi-1在腫瘤中表達上調，例如肝細胞肝癌、結腸癌、膠質瘤等，沉默其表達可以抑制結腸癌、肝癌等癌細胞的生長，其在腫瘤細胞生長中發(fā)揮促進作用〔9～11〕。本實驗表明，下調Musashi-1后膠質瘤細胞活力降低，說明Musashi-1在膠質瘤中可能發(fā)揮癌基因的作用。

腫瘤細胞凋亡減少腫瘤發(fā)生的重要原因之一，其受到細胞內Caspase蛋白家族成員的調控，Caspase蛋白家族也是目前為止研究最為透徹的細胞凋亡調控因子，其蛋白成員活化后可以誘導細胞凋亡的發(fā)生〔12〕。Caspase蛋白家族包括10個以上的蛋白成員，這些蛋白成員在活化之前沒有促凋亡作用，只有受到凋亡信號刺激以后可以誘導細胞凋亡的發(fā)生，Caspase-3是凋亡發(fā)生的下游執(zhí)行子，其活化水平升高后是不可逆細胞凋亡發(fā)生的標志〔13〕。本實驗的結果表明，下調Musashi-1后膠質瘤細胞凋亡水平升高，細胞中Caspase-3活化水平升高，提示下調Musashi-1具有激活Caspase級聯(lián)反應誘導細胞凋亡發(fā)生的作用。

EMT是腫瘤細胞遷移和侵襲的早期標志，EMT發(fā)生促進腫瘤細胞與相鄰細胞分開，其上皮標志物E-cadherin等表達水平下調，間質標志物vimentin等表達水平升高〔14〕。MMP-2和MMP-9均屬于MMPs成員，二者在腫瘤轉移中發(fā)揮促進作用〔15〕。在肝癌中的研究顯示，過表達Musashi-1后的腫瘤細胞侵襲能力增加，下調Musashi-1可以下調癌細胞的遷移能力〔16〕。本實驗顯示，下調Musashi-1后的膠質瘤細胞24 h的遷移、侵襲能力降低，細胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平下降，同時細胞間質標志物vimentin表達水平降低，上皮標志物E-cadherin表達水平升高，提示下調Musashi-1可能降低膠質瘤細胞EMT和侵襲遷移能力。

Musashi-1在膠質瘤中可能發(fā)揮促進作用，下調其表達后的膠質瘤細胞U251和U87活力、侵襲、遷移能力降低，細胞凋亡增多，而對于其具體的作用機制尚未研究。本實驗結果明確了Musashi-1在膠質瘤細胞凋亡、侵襲等生物學特性發(fā)揮中的作用，這對于研究Musashi-1在膠質瘤發(fā)生中的作用機制具有重要意義，為靶向基因治療膠質瘤提供了新思路。