周麗，李成剛，巫小云，馮澤怡

1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰442000；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院；3 十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡婦女常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，是一種發(fā)病多因性、臨床表現(xiàn)多態(tài)性的內(nèi)分泌失調(diào)綜合征，以月經(jīng)失調(diào)、排卵障礙、雄激素過多、高胰島素血癥和胰島素抵抗為主要特征。PCOS確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，國內(nèi)外也未形成統(tǒng)一、有效的治療方案，使之成為當(dāng)今婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的熱點和難點。據(jù)報道，約70%的PCOS患者合并胰島素抵抗。因此，胰島素抵抗被認(rèn)為是PCOS的重要病理生理特征[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的胰島素抵抗不僅存在于骨骼肌、脂肪、肝臟等經(jīng)典的胰島素靶組織或器官，也可存在于多囊卵巢組織內(nèi)，有可能是卵巢功能障礙的重要機(jī)制之一[2-4]。鳶尾素(Irisin)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種由肌肉組織分泌的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)白色脂肪棕色化和提高能量消耗的作用。YE等[5]認(rèn)為，運動、能量代謝與胰島素抵抗密不可分，尤其是在2型糖尿病中。有研究證實，Irisin可降低血糖水平，改善胰島素抵抗，有可能成為治療2型糖尿病的一個潛在靶點[6-7]。此外，Irisin還能參與其他代謝相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展，如代謝綜合征、非酒精性脂肪肝、糖尿病腎病等，并認(rèn)為其作用機(jī)制可能是通過減輕胰島素抵抗實現(xiàn)的[8-9]。但I(xiàn)risin能否改善PCOS患者卵巢胰島素抵抗尚不清楚。2018年1月—2019年7月，本研究觀察了Irisin對PCOS大鼠卵巢胰島素抵抗的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠45只，SPF級，4周齡，體質(zhì)量70～90 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK2016-0008。采用獨立通風(fēng)籠具分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃，相對濕度60%～70%，光照12 h明暗交替。所有大鼠正常攝食和飲水。實驗過程符合動物倫理學(xué)要求。重組人Irisin，購自北京百奧萊博科技有限公司；注射用脫氫表雄酮(DHEA)，購自湖北遠(yuǎn)程藥業(yè)有限公司。全波長酶標(biāo)儀，購自芬蘭雷勃公司；PCR儀，購自美國Bio-Rad公司。大鼠胰島素ELISA試劑盒，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。胰島素受體底物2(IRS-2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運子4(Glut4)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)p85α單克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠二抗，購自武漢華美生物工程有限公司。TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物分組與干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，經(jīng)陰道涂片觀察，將有正常動情周期大鼠納入實驗。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將大鼠分為對照組、模型組、Irisin組，每組15只。模型組、Irisin組每日頸背部皮下注射DHEA 0.06 mg/g+0.2 mL注射油劑，對照組每日頸背部皮下注射等體積油劑，連續(xù)20 d；第21天開始，Irisin組每日腹腔注射重組人Irisin 100 ng/g，對照組和模型組每日腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)14 d。

1.3 血清胰島素檢測 模型組建模成功次日，對照組和Irisin組同期，采集清晨空腹?fàn)顟B(tài)下眼眶靜脈血，3 000 r/min離心15 min、離心半徑15 cm，取上層血清，采用ELISA法檢測血清胰島素。各組末次腹腔注射后6 h處死，采集腹主動脈血，3 000 r/min離心15 min、離心半徑15 cm，取上層血清，采用ELISA法檢測血清胰島素。所有操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達(dá)檢測 無菌條件下摘取雙側(cè)卵巢，置于-80 ℃冰箱凍存。右側(cè)卵巢組織用于IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表達(dá)檢測，左側(cè)卵巢組織用于IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表達(dá)檢測。①IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表達(dá)檢測：采用Western blotting法。取右側(cè)卵巢組織，剪碎后加入含苯甲基磺酰氟的裂解液，冰上充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，離心半徑15 cm，取上清，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。根據(jù)蛋白濃度，調(diào)整上樣量，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴使蛋白充分變性，以40 μg/孔在10% SDS-PAGE凝膠上電泳(100 V，2 h)。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入IRS-2、Glut4、PI3K p85α單克隆抗體(稀釋比均為1∶1 000)和內(nèi)參β-actin一抗(稀釋比1∶1 500)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠二抗(稀釋比1∶3 000)，常溫孵育1 h。ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)采集各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。②IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表達(dá)檢測：采用RT-qPCR法。取左側(cè)卵巢組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。取總RNA 1 μg，以O(shè)ligo DT為引物，按PrimeScript RT Reagent Kit說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按Real-time PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：IRS-2上游引物5′-TGACCAGTCCCACATCAGGC-3′，下游引物5′-CTGCACGGATGACCTTAGCG-3′；Glut4上游引物5′-CTGTTGCCCTTCTGTCCTGA-3′，下游引物5′-CAACTTCCGTTTCTCATCCTTCA-3′；PI3K p85α上游引物5′-GGTGAGGAACGAAGAATGGC-3′，下游引物5′-TCCGAGGCAAGACAGGGATA-3′；β-actin上游引物5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。PCR反應(yīng)體系共50 μL：Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，DNA模板 5 μL，滅菌雙蒸水15 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清胰島素水平比較 見表1。

表1 各組不同時間血清胰島素水平比較

2.2 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白相對表達(dá)量比較

2.3 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表達(dá)比較 見表3。

表3 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

PCOS是育齡期女性的常見病、多發(fā)病，是以高雄激素血癥、稀發(fā)排卵或無排卵、卵巢多囊樣改變等為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌失調(diào)綜合征。文獻(xiàn)報道，約70%的PCOS患者合并胰島素抵抗，同時其胰島素敏感性降低35%～40%，與非胰島素依賴型糖尿病女性相似，故PCOS患者常常發(fā)展為代償性高胰島素血癥[1]。由此可見，PCOS的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗密切相關(guān)。以往研究認(rèn)為，PCOS卵巢功能障礙的發(fā)病機(jī)制與外周經(jīng)典靶組織或器官的胰島素抵抗導(dǎo)致代償性高胰島素血癥對卵巢的作用有關(guān)。高胰島素環(huán)境下，卵巢間質(zhì)合成雄激素增多[2]；在卵巢內(nèi)，胰島素可引起竇前卵泡發(fā)育停滯，也可引起顆粒細(xì)胞凋亡[10-11]。但近年研究發(fā)現(xiàn)，PCOS卵巢也存在胰島素抵抗和糖代謝異常，這可能是導(dǎo)致PCOS卵巢功能障礙的重要機(jī)制[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，PCOS卵巢胰島素受體數(shù)量及其與配體親和力均未發(fā)生改變，而胰島素受體底物IRS-1、IRS-2表達(dá)和磷酸化異常[12]，提示PCOS卵巢胰島素抵抗是胰島素受體信號結(jié)合后缺陷。胰島素受體底物IRS-1優(yōu)先調(diào)節(jié)胰島素信號的促有絲分裂途徑，而IRS-2主要調(diào)節(jié)胰島素的代謝通路[13]。胰島素與受體結(jié)合后使受體激活，激活的受體可使IRS-2酪氨酸磷酸化，而磷酸化的IRS-2進(jìn)一步通過PI3K、Glut4、Ras/MAPK等一系列信號傳導(dǎo)過程實現(xiàn)葡萄糖信號的跨膜轉(zhuǎn)運。因此，影響胰島素受體反應(yīng)鏈中的任何一個環(huán)節(jié)均可導(dǎo)致胰島素抵抗。

Irisin是BOSTROM研究團(tuán)隊于2012年發(fā)現(xiàn)的一種肌源性細(xì)胞因子，由骨骼肌分泌，是Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白5經(jīng)蛋白水解酶水解后形成的可分泌多肽片段。Irisin幾乎分布于機(jī)體所有的組織和器官，如骨骼肌、心臟、大腦、脂肪等[14]。Irisin在骨骼肌合成后迅速釋放入血，誘導(dǎo)具有存儲作用的白色脂肪轉(zhuǎn)化為具有產(chǎn)熱作用的棕色脂肪，從而增加能量消耗，減輕體質(zhì)量。隨著研究的不斷深入，學(xué)者們逐漸發(fā)現(xiàn)，Irisin還可通過內(nèi)分泌作用參與能量代謝紊亂相關(guān)性疾病，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心腦血管疾病等[8-9]。有研究證實，Irisin可降低血糖水平，改善胰島素抵抗[5-7]。因此，以胰島素抵抗為重要內(nèi)分泌改變的PCOS與Irisin的關(guān)系成為近年研究的熱點。有研究報道，PCOS患者多伴有Irisin水平改變，并認(rèn)為Irisin可作為早期診斷PCOS的指標(biāo)[15]。MASAELI等[16]研究報道，PCOS患者外周血循環(huán)Irisin水平與胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系，并認(rèn)為Irisin可作為評估PCOS患者胰島素抵抗程度的指標(biāo)。BOUSMPOULA等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清和卵泡液中Irisin水平均高于正常女性。有研究還發(fā)現(xiàn)，Irisin能夠促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇分泌[18]，提示Irisin可能對卵巢功能具有一定影響。但其作用機(jī)制鮮見報道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠血清胰島素水平升高，卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達(dá)降低，證實PCOS除了伴隨全身胰島素抵抗外，也存在卵巢局部胰島素抵抗。本研究還發(fā)現(xiàn)，通過Irisin干預(yù)，PCOS大鼠血清胰島素水平下降，卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達(dá)較模型組升高，提示Irisin除了改善PCOS高胰島素血癥外，還可通過增加胰島素受體后信號通路活化，改善卵巢胰島素抵抗。這為探索Irisin對卵巢功能的影響提供了新的方向，同時為PCOS治療提供了新的靶點。本研究Irisin組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達(dá)未達(dá)到對照組水平，可能與卵巢胰島素信號通路尚未恢復(fù)至正常有關(guān)。持續(xù)給予Irisin腹腔注射能否恢復(fù)正常的胰島素信號通路，將是我們今后研究的重點。

綜上所述，Irisin能夠改善PCOS大鼠卵巢胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能是通過增加卵巢胰島素抵抗相關(guān)信號分子IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達(dá)實現(xiàn)的。但I(xiàn)risin是通過何種機(jī)制引起PCOS卵巢胰島素抵抗相關(guān)信號分子表達(dá)增加的尚需進(jìn)一步研究。