郭曉宇，米建強，米優(yōu)嘉，左汪洋

程序性死亡受體-1(programmed death receptor-1，PD-1)及程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)的免疫抑制劑已應(yīng)用于惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等諸多腫瘤的治療，且已取得了相應(yīng)的效果。檢測消化系統(tǒng)腫瘤組織中PD-1/PD-L1的表達情況，可幫助消化系統(tǒng)腫瘤的診斷及指導(dǎo)免疫抑制劑在消化系統(tǒng)腫瘤治療中的應(yīng)用。本文通過對PD-1/PD-L1的機制、應(yīng)用情況及應(yīng)用前景、有關(guān)PD-1/PD-L1的檢測及判讀做一綜述，為后續(xù)的研究提供參考。

1 PD-1/PD-L1的結(jié)構(gòu)、功能和作用

程序性死亡受體-1稱為PD-1(即CD279)，是CD28家族中的一員，細(xì)胞的穿膜受體之一，由288個氨基酸排列而成的蛋白分子組成，主要表達于活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞表面[1-2]。PD-1有兩個配體，分別是程序性死亡配體-1(PD-L1)和程序性死亡配體-2(PD-L2)，兩者基因均位于染色體9p24.1，有37%同源序列，可編碼產(chǎn)生Ⅰ型跨膜蛋白。 PD-L1又被稱為B7-H1，是B7家族中的一員，可在多種腫瘤細(xì)胞表面表達，PD-L2主要在抗原提呈細(xì)胞表面表達[2]。在腫瘤的發(fā)生中，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)需要雙信號參與，第一信號是由抗原、T細(xì)胞受體三元復(fù)合體、主要組織相容性復(fù)合體組成的抗原識別信號(pMHC-TCR) 組成，第二信號是B7與CD28所形成的共刺激信號[2-3]，第一信號和第二信號均能激活T細(xì)胞，起到免疫防御的作用。PD-1/PD-L1的結(jié)合，可使T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生磷酸化，結(jié)合蛋白酪氨酸磷酸酶，形成SHP-2，可抑制第一信號產(chǎn)生的ZAP-70、PI3K等分子，從而抑制T細(xì)胞的活化[2-3]。另外，PD-1可以通過增加轉(zhuǎn)錄因子BATF的表達，進一步對抗由TCR和CD28共同刺激產(chǎn)生的下游信號，抑制T細(xì)胞的功能[3]。除PD-1、PD-L1為免疫治療的靶點外，其他的免疫靶點也逐漸引起人們注意，如LAG3、TIM3、CTLA-4等。研究顯示胃癌的發(fā)病與TIM3基因的改變有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)在胃癌患者T細(xì)胞上的表達明顯高于正常組織，靶向阻斷TIM3通路有望成為免疫靶向治療胃癌的新方法[4]。

2 PD-1/PD-L1在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究

2.1 PD-1/PD-L1在胃癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中排名第二、第三[5]。在我國，胃癌每年確診量有41萬例，治療后其5 a生存率仍低于40%[6]，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。而胃癌的診斷及治療方法目前仍以組織病檢及手術(shù)和放化療為主，雖然對早期胃癌的防治取得了較好的成績，但早期胃癌發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時大多已是進展期胃癌[5]。近年來研究顯示PD-L1在胃癌組織中表達率為46.6%～70.1%[7]，并與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤等相關(guān)，提示PD-L1可能是胃癌預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)[8]。丁思思等[9]采集并對比18例健康者的外周血和44例胃腺癌患者分別在術(shù)前術(shù)后的外周血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達和CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1的表達情況，結(jié)果表明：與健康組相比，胃癌患者外周血CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達水平顯著增加；與術(shù)前相比，術(shù)后外周血CD4+T和CD8+T細(xì)胞PD-L1表達顯著增加。說明PD-L1在CD14+單核細(xì)胞的表達可以預(yù)測腫瘤的發(fā)生情況，術(shù)后外周血T細(xì)胞PD-L1的表達升高，可能與手術(shù)創(chuàng)傷所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。而PD-1無論是術(shù)前或術(shù)后在T細(xì)胞表面均無變化，進一步說明在應(yīng)激作用下PD-L1在T細(xì)胞上的表達與PD-1的表達無相關(guān)性[9]。提示外周血中CD4+T、CD8+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達對胃癌患者的治療及預(yù)后具有預(yù)測價值。

2.2 PD-1/PD-L1在食管癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系食管癌的發(fā)病僅次于肺癌、胃癌和肝癌，是最常見的消化道腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，有70%的食管癌發(fā)生在中國，該疾病嚴(yán)重影響國民健康。一項收納了1 119例食管癌的Meta分析顯示：PD-L1高表達者的死亡風(fēng)險高(HR=1.90，95%CI：1.28～2.81，P=0.001)，且PD-L1的表達與發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性，提示其可能為食管癌預(yù)后的標(biāo)記物[10]。陳俊升等[11]收集67例食管癌術(shù)后的標(biāo)本，檢測PD-1/PD-L1的表達，分別以5%和10%為陽性標(biāo)準(zhǔn)，PD-1的陽性表達率為67.2%和61.2%，PD-L1的陽性表達率為31.3%和25.4%，研究臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系，得出結(jié)論：PD-1/PD-L1在食管癌組織中存在高表達，且PD-L1表達陽性高低可能與腫瘤浸潤深度有關(guān)。腫瘤的位置、病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，對食管癌中PD-L1的表達均有影響。然而，另有文獻指出：PD-L1陽性患者的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險會降低，并且指出PD-L1會是食管癌預(yù)后的有利指標(biāo)，而PD-1的表達與臨床病理因素及食管癌的預(yù)后無顯著相關(guān)性[12]。2015年美國Chicago的ASCO會議中，Keynote-012的Ⅰ期研究發(fā)現(xiàn)，隨著PD-L1表達水平的提高，患者ORR、PFS有降低的趨勢。對于這兩種相悖的實驗結(jié)果，Jiang等[12-13]的研究解釋為：早期食管鱗癌患者的PD-L1高表達，并作為食管癌患者的有利預(yù)后因素，是因為早期食管鱗癌患者體內(nèi)PD-L1可通過與機體內(nèi)非PD-1的免疫受體結(jié)合，從而增強了抗腫瘤的免疫反應(yīng)，使T細(xì)胞增殖，免疫分子(如白介素-10和干擾素-γ)分泌增強；而食管癌晚期PD-L1則主要與PD-1結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，造成免疫抑制，最終導(dǎo)致較差的預(yù)后。

2.3 PD-1/PD-L1在結(jié)直腸癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系結(jié)直腸癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，5 a生存率低于12%，研究顯示PD-L1在結(jié)直腸癌中的表達為45.0%[14]。湯國軍等[14]選取100例結(jié)直腸癌標(biāo)本、100例癌旁組織標(biāo)本、100例結(jié)直腸腺瘤標(biāo)本、100例正常標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法進行實驗，發(fā)現(xiàn)PD-L1在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、癌旁、正常結(jié)直腸中的陽性表達率依次遞減，最終得出結(jié)論：結(jié)直腸癌組織中PD-L1表達水平與結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)，PD-L1在結(jié)直腸癌中的高表達預(yù)示著不良的預(yù)后。另有雷星等[15]研究PD-L1在結(jié)直腸癌、癌旁、正常組織中的表達，及PD-L1的表達與結(jié)直腸癌患者年齡、TNM分期、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理關(guān)系得出：PD-L1在結(jié)腸癌組織中的表達明顯升高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

2.4 PD-1/PD-L1在胰腺癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系胰腺解剖位置較深，發(fā)病隱匿，胰腺癌是惡性程度最高的消化系統(tǒng)腫瘤[16]。李俊昊等[17]收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的68例胰腺癌患者的蠟塊標(biāo)本，進行PD-L1的免疫組織化學(xué)染色，陽性率為80.9%，并利用Kaplan-Meier法、Log-Rank檢驗及Cox比例風(fēng)險模型分析了PD-L1的表達與生存時間的關(guān)系得出：PD-L1與可切除胰腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，PD-L1表達量高預(yù)示著胰腺癌不良的預(yù)后。免疫試劑的推廣，在胰腺癌的應(yīng)用中顯示：PD-L1在胰腺癌中雖有表達，但總體低于非小細(xì)胞肺癌、惡性黑色素瘤，單藥應(yīng)用治療胰腺癌，沒有取得理想的療效[18]，這可能與胰腺腫瘤微環(huán)境的高度抑制性有關(guān)[19]。所以，免疫抑制劑在胰腺癌中的應(yīng)用，仍需在細(xì)胞及分子水平上的進一步的臨床試驗和研究。

2.5 PD-1/PD-L1在膽囊癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系膽囊癌在消化系統(tǒng)中的發(fā)病率排第六，由于解剖學(xué)位置距體表較深，癥狀隱匿，這為膽囊癌的診斷和治療帶來了困難。童玲等[20]搜集41例膽囊癌患者大體標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法進行實驗，統(tǒng)計PD-L1在膽囊標(biāo)本上的表達情況，用χ2檢驗比較膽囊癌和癌旁組織中的表達，得出結(jié)論：PD-L1在膽囊癌旁及膽囊癌中的表達率分別為0%和34.14%，同時χ2檢驗的結(jié)果顯示：膽囊癌和癌旁組織PD-L1的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 PD-1/PD-L1在肝癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系肝臟病變隱匿，與酗酒、抽煙、不良飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)，確診時往往已錯失最佳治療時機。程小珍等[21]研究肝癌患者肝動脈化療栓塞術(shù)(trancatheter arterial chemoembolization,TACE)前后外周血中PD-1、PD-L1的表達，發(fā)現(xiàn)在肝癌患者外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞及APC細(xì)胞表面PD-1與PD-L1的表達要高于正常組，術(shù)前術(shù)后PD-1和PD-L1在外周血中的表達均有差異，得出肝癌患者外周血PD-1、PD-L1表達升高。周曉思等[22]收集原發(fā)性肝癌標(biāo)本81例，利用免疫組織化學(xué)法進行染色，其中29例癌旁組織作為正常對照，結(jié)果，肝癌實驗組中AFP和PD-L1陽性表達率明顯高于對照組，提示術(shù)前AFP濃度可作為PD-L1抗體治療的重要指標(biāo)[22]。綜上，PD-1、PD-L1在肝癌組織中的表達有望成為指導(dǎo)肝癌治療及評判預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)之一。

3 PD-1/PD-L1檢測標(biāo)準(zhǔn)的篩選

細(xì)胞陽性顯色指的是細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒。實驗結(jié)果的評定往往是結(jié)合細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)百分比共同評定。染色強度：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。先低倍顯微鏡下觀察整張切片，分別在腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)細(xì)胞隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%。陽性細(xì)胞分級為：陽性細(xì)胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分。染色強度評分和陽性細(xì)胞分級評分的乘積>3分為陽性表達。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上任一項陽性均為陽性表達；癌細(xì)胞或癌間質(zhì)淋巴細(xì)胞上任一項陽性，該標(biāo)本也為陽性表達[8]。為保留抗原的活性，應(yīng)用PD-L1做免疫組織化學(xué)染色的標(biāo)本需在3 a以內(nèi)。不同克隆號抗體評判標(biāo)準(zhǔn)略有不同，PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中，選用TPS(Tumor Proportion Score)判讀標(biāo)準(zhǔn)。如：克隆號為22C3、28-8、SP263單克隆抗體染色的陽性定義為：任何強度完整或部分腫瘤細(xì)胞膜染色。評分不考慮腫瘤細(xì)胞質(zhì)染色，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的染色也不考慮在內(nèi)。而SP142抗體克隆PD-L1染色陽性定義：PD-L1陽性免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均被考慮納入PD-L1染色陽性標(biāo)準(zhǔn)[23-24]。除非小細(xì)胞肺癌的其他腫瘤，選用的是CPS(Combined Positive Score)判讀標(biāo)準(zhǔn)，即：任何強度的染色細(xì)胞[腫瘤細(xì)胞、癌巢內(nèi)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和或鄰近的間質(zhì)細(xì)胞(胞膜和或胞質(zhì)染色)]與腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比值，乘以100[25]。

4 PD-1/PD-L1免疫抑制劑在腫瘤治療中的應(yīng)用

應(yīng)用免疫抑制劑治療腫瘤，可以是阻斷PD-1分子應(yīng)答途徑，也可以是阻斷PD-L1分子應(yīng)答途徑，或同時阻斷PD-1/PD-L1分子應(yīng)答途徑，因此有PD-1免疫抑制劑和PD-L1免疫抑制劑[26]。PD-1/PD-L1免疫抑制劑對不同腫瘤的治療尚處于不斷的臨床試驗中，一項包含了1 388名胃食管腫瘤患者的薈萃分析顯示：應(yīng)用PD-1及PD-L1免疫抑制劑治療后，患者客觀反應(yīng)率(ORR)=10%，疾病控制率(DCR)=32%，總生存期OS(6個月)=52%，無進展生存期PFS(6個月)=18%，OS(12個月)=40%，PFS(12個月)=8%，3級以上不良事件發(fā)生率為12%(95%可信區(qū)間:10%～15%)。數(shù)據(jù)分析表明，PD-1/PD-L1免疫治療對晚期胃癌患者具有有效的抗腫瘤活性和可控的不良反應(yīng)[27]。

4.1 PD-1免疫抑制劑在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究

派姆單抗(Pembrolizumab)是特異性抗PD-1的人源化IgG4單克隆抗體，在KEYNOTE系列實驗中顯示出良好療效，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了其在晚期或不可切除的Ipilimumab耐藥的黑色素瘤，以及以鉑類為基礎(chǔ)化療耐藥且PD-L1特定檢測方法陽性的晚期非小細(xì)胞肺癌中使用，它是FDA唯一一個批準(zhǔn)在胃癌治療中作為三線治療的免疫抑制劑[28]。在KEYNOTE-012臨床試驗中，39例PD-L1陽性表達的晚期胃癌患者持續(xù)應(yīng)用Pembrolizumab 24個月，結(jié)果22%的患者確認(rèn)獲得了影像學(xué)部分緩解，中位起效時間為8周，中位療效持續(xù)時間為24周，隨后的研究也證實 PD-L1的表達水平與客觀緩解率(ORR)相關(guān)[29-30]。另外有關(guān)Pembrolizumab在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移胃食管癌患者中療效的三期臨床試驗正在進行中，KEYNOTE-062和KEYNOTE-061分別將單藥、單純化療、聯(lián)合順鉑或 5-氟尿嘧啶(5-Fu)的對比，總生存期(OS)與完全緩解率(CPS)沒有顯示優(yōu)于單純化療組，但是單藥比化療安全性高。另外，Pembrolizumab在肝癌中的治療研究顯示：在KEYNOTE-224的開放性二期臨床試驗中，對索菲拉尼治療無法耐受的104例患者，應(yīng)用Pembrolizumab，患者的ORR為16.3%，中位PFS為4.8個月，并未達到預(yù)期的療效，但是KEYNOTE-240及KEYNOTE-394對Pembrolizumab單藥應(yīng)用于肝癌的治療仍在研究中[31]。

納武單抗(Nivolumab)也是抗PD-1的人源化IgG4單克隆抗體之一，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了與Pembrolizumab同樣的適應(yīng)證。一項收納493例胃癌及胃食管癌患者的臨床試驗，將使用和未使用曲妥珠單抗的患者分為兩組，其中330例患者使用Nivolumab(59例用過曲妥珠單抗，271例沒有用過曲妥珠單抗)，163例患者使用安慰劑(22例用過曲妥珠單抗，141例沒有用過曲妥珠單抗)，結(jié)果顯示，使用Nivolumab的患者總的生存期和無疾病進展期均比對照組長，說明不管曲妥珠單抗以前在晚期胃癌及食管癌患者中的使用情況如何，Nivolumab作為三線或二線治療方案是有效和安全的[30,32]。

4.2 PD-L1免疫抑制劑在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究

Avelumab是一種人抗PD-L1的IgG1單克隆抗體，在晚期轉(zhuǎn)移性胃和胃食管結(jié)合部癌的早期研究中顯示出抗腫瘤活性，可用作一線維持治療[33]。有關(guān)Avelumab的一項開放的三期臨床試驗，收集499名局部晚期/轉(zhuǎn)移性且HER2陰性的胃和胃食管結(jié)合部腺癌患者，在接受一線奧沙利鉑、氟嘧啶化療12周病情穩(wěn)定后，以1∶1的比例隨機接受Avelumab維持治療或繼續(xù)化療，結(jié)果PD-L1陽性人群的總體存活率均有提高，說明Avelumab治療胃癌的安全性和有效性[27]。另外正在研究中的PD-L1抑制劑還有阿特朱單抗(Atezolizumab)、度伐單抗(Durvalumab)等，其安全性及有效性仍在進一步驗證。

4.3 靶向藥物等的聯(lián)合用藥

癌癥的發(fā)生是癌癥細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)與免疫細(xì)胞等腫瘤微環(huán)境共同作用的結(jié)果。有研究顯示抗PD-1、PD-L1抗體在胃癌治療方面尚有一定局限性，需要從多方面著手。有研究報道曲妥珠單抗和免疫治療結(jié)合方案可能成為胃食管癌患者新的治療方案。Stagg等[34]發(fā)現(xiàn)PD-1、HER2抗體聯(lián)合治療可提高HER2靶向治療在模型小鼠中的療效，并提出了假設(shè)：免疫治療可以增強免疫介導(dǎo)的抗HER2治療效果。而且據(jù)統(tǒng)計，50%PD-L1陽性的胃癌患者都過度表達HER2，因此曲妥珠單抗和免疫治療結(jié)合有望提高胃癌患者的治療效果，成為新的治療方案。

Ramucirumab與Nembrolizumab聯(lián)合用于治療胃-食管交界處腫瘤，非小細(xì)胞肺癌及尿路上皮癌，一項1a/b階段的臨床試驗顯示：收入的92例患者，其中41例胃-食管交界處腫瘤，27例非小細(xì)胞肺癌，24例尿路上皮癌，總體客觀緩解率達15.2%，參與試驗的患者，發(fā)生的不良反應(yīng)有高血壓、腹痛等，總體上，Ramucirumab與Pembrolizumab聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤的治療，安全易于管理，這種組合可以在有或沒有化療的情況下進一步探索，特別是對于單劑檢查點抑制劑沒有顯示出比化療有額外益處的腫瘤患者[35]。

有關(guān)PD-1/PD-L1的免疫抑制劑在多種腫瘤治療中都取得了成績，在非小細(xì)胞肺癌和惡性黑色素瘤中的治療部分已經(jīng)被列入NCCN國際治療指南，在消化系統(tǒng)腫瘤治療中的應(yīng)用也在進一步臨床試驗中。目前主要存在的問題：①符合免疫治療的消化道腫瘤患者的篩選標(biāo)準(zhǔn)如何評定；②PD-L1高表達的患者接受免疫治療是否會有更好的療效及預(yù)后；③PD-1/PD-L1適合應(yīng)用免疫抑制劑的臨床檢測量；④怎樣提高符合免疫治療患者的檢出率，外周血的測量是否可行，免疫組織化學(xué)法和基因的檢測，哪一個更為經(jīng)濟有效；⑤免疫抑制劑在消化道腫瘤中的研究仍缺少大數(shù)據(jù)臨床試驗支持，適應(yīng)癥和并發(fā)癥尚不十分清楚，對于免疫治療出現(xiàn)并發(fā)癥的處理，尚缺少臨床試驗及統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)支持。免疫治療雖存在諸多問題，但為消化道腫瘤治療提供了新思路。