阮豪杰，許海軍，陳 攀，閆錦陽(yáng)，高社干

在哺乳動(dòng)物中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)通路能夠影響細(xì)胞分化、增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，參與胚胎發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)、纖維化、傷口愈合、腫瘤進(jìn)展等發(fā)育及病理學(xué)反應(yīng)[1]。全世界每年確診的食管癌患者約為45萬(wàn)人，死亡率在所有癌癥中位居第六位[2]。食管癌主要有兩種組織學(xué)亞型：食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)，每種亞型均具有已知的危險(xiǎn)因素和病理特征。ESCC占全世界食管癌病例的90%，但某些地區(qū)EAC的發(fā)病率正在上升，甚至超過(guò)了ESCC[3]。盡管最近在食管癌的診斷和治療方面取得了進(jìn)展，但食管癌的預(yù)后仍然很差，5 a生存率約為15%～25%，主要是由于晚期食管癌已發(fā)生轉(zhuǎn)移才被確診[2]。因此有必要更好地了解食管癌的分子發(fā)病機(jī)制，以開發(fā)新的生物標(biāo)志物和靶向治療方法。

1 TGF-β的激活及其受體

TGF-β超家族包括至少40個(gè)結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成、免疫調(diào)節(jié)、炎癥、癌癥等多種生物學(xué)過(guò)程[4]。TGF-β激活的方式復(fù)雜多樣。首先，與TGF-β結(jié)合的延遲相關(guān)肽(latency-associated peptides,LAPs)在凝血酶素-1(thrombospondin-1,TSP-1)作用下構(gòu)象發(fā)生變化[5]，隨后在轉(zhuǎn)化酶、血纖維蛋白溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等酶的共同作用下，TGF-β游離而激活[6]；其次，低pH水平的局部微環(huán)境或照射引起的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生可以激活TGF-β[7]；另外，肌成纖維細(xì)胞的機(jī)械收縮可以進(jìn)一步激活潛在的TGF-β。上述這些機(jī)制導(dǎo)致具有生物活性的TGF-β釋放，從而結(jié)合TGF-β受體和下游信號(hào)分子激活。TGF-β家族蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可分為多種亞型，包括TGF-β、激活素/抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白/生長(zhǎng)分化因子[8]。TGF-β受體傳導(dǎo)信號(hào)包括TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ和TGF-β RⅢ。在大多數(shù)組織中，TGF-β受體通過(guò)兩個(gè)TGF-β RⅠs和兩個(gè)TGF-β RⅡs形成異四聚體復(fù)合物來(lái)起作用[9]。

2 Smad依賴性的信號(hào)通路

TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)依賴于Smad蛋白家族?；钚訲GF-βⅠ與細(xì)胞表面的TGF-β RⅡ結(jié)合激活TGF-β RⅠ，進(jìn)而使Smads(R-Smads)磷酸化。R-Smads包括Smad2和Smad3、R-Smad和Co-Smad分子在蛋白質(zhì)的氨基端和羧基端有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，即MH1和MH2結(jié)構(gòu)域、MH1和MH2結(jié)構(gòu)域之間包含一個(gè)連接區(qū)結(jié)構(gòu)域。TGF-βⅠ型受體的R-Smad磷酸化發(fā)生于SXS基序C端的兩個(gè)絲氨酸殘基。Smad 3和Smad 4能夠直接與保守的5’-CAGA-3’DNA結(jié)合基序相結(jié)合，但Smad2卻不含這個(gè)SXS基序。R-Smad與Smad 4形成異構(gòu)體復(fù)合物是由MH2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的，該復(fù)合物的形成暴露了核輸入信號(hào)，同時(shí)屏蔽了核輸出信號(hào)，導(dǎo)致其在細(xì)胞核內(nèi)積聚。在細(xì)胞核中，該復(fù)合物作為轉(zhuǎn)錄因子能夠與其他DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、輔激活因子、抑制因子以及染色質(zhì)重塑因子相互協(xié)同作用，激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[10]。I-Smad7具有與R-Smads和Smad4 MH2結(jié)構(gòu)域同源的羧基末端區(qū)域，可拮抗TGF-β受體/Smad信號(hào)活性。在基礎(chǔ)條件下，Smad7存在于細(xì)胞核，但在TGF-β誘導(dǎo)的受體復(fù)合物形成時(shí)，Smad7可易位至細(xì)胞膜[11]。Smad7能夠與激活的TGF-β受體復(fù)合物結(jié)合，從而阻斷R-Smads和激活的受體之間的相互作用，抑制下游信號(hào)的傳導(dǎo)。此外，Smad7還可在細(xì)胞核中與E3-泛素連接酶Smurf1或Smurf2相互作用，在TGF-β激活時(shí)，Smad7-Smurf復(fù)合物易位到細(xì)胞膜，誘導(dǎo)TGF-β受體泛素化及其蛋白酶體降解途經(jīng)激活[12]。Smad7還可直接與DNA結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性拮抗Smad-DNA復(fù)合物形成，從而抑制TGF-β介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性[13]。

3 Smad非依賴性的信號(hào)通路

TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)并不完全依賴Smads，因而進(jìn)一步增加了TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜性。TGF-β能夠誘導(dǎo)多種組織中上皮和內(nèi)皮細(xì)胞Erk信號(hào)通路的激活，促進(jìn)粘著連接的溶解和細(xì)胞遷移，該過(guò)程一方面通過(guò)間接活化TGFα及纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子自分泌循環(huán)[14]，另一方面是直接通過(guò)Src調(diào)節(jié)或通過(guò)TGF-β RⅡ自身磷酸化酪氨酸殘基[15]。此外，TGF-β RⅡ自身磷酸化酪氨酸殘基能夠激活SHCA，從而促進(jìn)SHCA/Grb2/SOS復(fù)合物的形成。然后，該復(fù)合物通過(guò)C-RAF、MEK和ERK激活下游信號(hào)通路，激活細(xì)胞膜上的腎素—血管緊張素系統(tǒng)。TGF-β還可以依據(jù)細(xì)胞環(huán)境分別通過(guò)MKK4和MKK3/6促進(jìn)JNK和p38-MAPK的激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞遷移[16-17]。在上游，不是通過(guò)TRAF6介導(dǎo)的TAK1的富集，就是通過(guò)MAPKK KS、MEK1和MLK3磷酸化MKKs[18-19]。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路亦介導(dǎo)一些TGF-β生物學(xué)功能。從機(jī)制上來(lái)看，PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基似乎在結(jié)構(gòu)上捆綁于TGF-βRⅡ，接近于復(fù)合物上富集TGF-β RⅠ激活PI3K和啟動(dòng)下游信號(hào)的TGF-β刺激。TGF-β能夠以非依賴性的Smad2/3方式迅速激活RhoA和Cdc42/Rac1途徑，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合參與EMT過(guò)程[20]。經(jīng)典(Smad依賴性的)和非經(jīng)典(非Smad依賴性的)TGF-β信號(hào)通路之間的交互作用有助于腫瘤的發(fā)展[21]。

在癌變和腫瘤進(jìn)展中，TGF-β具有基礎(chǔ)性作用。然而，多數(shù)研究確定TGF-β在這一過(guò)程中具有雙重作用。腫瘤發(fā)生之前，TGF-β能夠抑制正常及癌前病變的上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，由于腫瘤細(xì)胞中基因表達(dá)的增加和表觀遺傳改變，伴隨局部分泌的TGF-β水平的遞增，促進(jìn)了侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因?yàn)門GF-β的功能取決于組織類型和遺傳背景，這進(jìn)一步增加了其功能的復(fù)雜性[22]。

4 TGF-β與食管癌

食管癌是中國(guó)第五大惡性腫瘤，已成為中國(guó)癌癥死亡的第四大病因[23]。食管癌的危險(xiǎn)因素包括吸煙、不良飲食習(xí)慣和維生素缺乏等[24]。通常，TGF-β家族配體與TGF-β受體胞外域結(jié)合后，觸發(fā)了經(jīng)典Smad蛋白信號(hào)下游效應(yīng)分子激活，導(dǎo)致了與組織穩(wěn)態(tài)、腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展相關(guān)的重要基因的轉(zhuǎn)錄[25]。有趣的是，TGF-β信號(hào)在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生中似乎具有雙重作用：在早期階段它是一種生長(zhǎng)抑制因子，但在晚期階段，TGF-β促進(jìn)了腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移[26]。這種雙重作用在ESCC和EAC中已證實(shí)。食管癌發(fā)生早期階段，TGF-β信號(hào)通路似乎對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有抑制作用，EAC和ESCC細(xì)胞系均通過(guò)下調(diào)Smad4或c-Myc表達(dá)，而降低TGF-β反應(yīng)性[27]。與此一致的是，Smad4在EAC的化生—增生—腺癌病變過(guò)程中表達(dá)逐漸減少，Smad4表達(dá)恢復(fù)后，對(duì)增殖的抑制能力恢復(fù)[28]。有趣的是，ESCC中TGF-β研究結(jié)果并不一致。DACH1甲基化導(dǎo)致TGF-β下調(diào)或Smad4表達(dá)降低，與浸潤(rùn)深度增加、腫瘤分期晚和分化差有關(guān)[29-30]。 蛋白酶體降解引起的TGF-β下調(diào)實(shí)際上抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲[31]。盡管如此，針對(duì)ESCC患者的研究結(jié)果仍支持TGF-β的腫瘤抑制作用，信號(hào)傳導(dǎo)減少與更具侵襲性的腫瘤特征和更差的預(yù)后相關(guān)[32]。

在腫瘤發(fā)生晚期，TGF-β似乎具有促腫瘤作用。據(jù)認(rèn)為，這種“轉(zhuǎn)換”主要是由中介蛋白質(zhì)分子的丟失所介導(dǎo)的，而中介蛋白的丟失是適當(dāng)控制TGF-β腫瘤抑制功能所必需的。例如，β2-spectrin(β2SP)是一種銜接蛋白，在細(xì)胞—細(xì)胞相互作用和維持上皮細(xì)胞極性中起著至關(guān)重要的作用。在EAC中，腫瘤細(xì)胞中β2SP的缺失導(dǎo)致SOX9和c-Myc的表達(dá)增加，而其他TGF-β靶標(biāo)，如E-cadherin和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑p21和p27的表達(dá)降低[33]。TGF-β還能激活成纖維細(xì)胞，這也有助于腫瘤浸潤(rùn)、血管生成和EMT[34]。與健康對(duì)照組相比，食管癌患者的血清及腫瘤組織中TGF-β表達(dá)增高與腫瘤分期及預(yù)后有關(guān)[35]，并且TGF-β水平較高者，放療后血清TGF-β水平降低[36]。癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在癌癥發(fā)生發(fā)展的多階段過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，CAF表達(dá)成纖維細(xì)胞活化蛋白-α和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，是由癌細(xì)胞分泌的TGF-β等因子誘導(dǎo)[37]。最近的研究也表明，miRNAs參與成纖維細(xì)胞向CAFs的轉(zhuǎn)化[38]，這一發(fā)現(xiàn)在ESCC中得到了證實(shí)[39]。在這種狀態(tài)下，CAFs可以通過(guò)分泌活性因子與腫瘤或其他間質(zhì)細(xì)胞通訊，激活促炎途徑，破壞免疫監(jiān)視，改變細(xì)胞外基質(zhì)，從而調(diào)節(jié)EMT[40]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在ESCC中的表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)[41]。另外，TGF-β的過(guò)表達(dá)和TβR的低表達(dá)與ESCC的浸潤(rùn)深度和病理分期有關(guān)[42]。Smad4在ESCC中的表達(dá)與浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)[43]。Smad2的降解也可能導(dǎo)致ESCC腫瘤的發(fā)生和預(yù)后不良[44]。最后，TGF-β/Smad信號(hào)還能夠通過(guò)PTEN/PI3K促進(jìn)ESCC的EMT發(fā)生[45-46]?？傊?，這些變異使TGF-β通過(guò)EMT促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和最終轉(zhuǎn)移。實(shí)際上，在EAC和ESCC中，TGF-β信號(hào)通路激活增加晚期腫瘤分期，并與轉(zhuǎn)移、治療耐藥有關(guān)[47-48]。

microRNAs是多種癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物之一，并可調(diào)節(jié)食管癌中的TGF-β信號(hào)[49]。miR-17/20a通過(guò)靶向TβR2和Smad錨定受體激活降解來(lái)抑制TCC-β/整合素β6亞基途徑，介導(dǎo)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲[50]。此外，TGF-β在miR-455-3p介導(dǎo)的ESCC進(jìn)展中起作用[51]。miR-655通過(guò)靶向TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)所需的ZEB1和TβRⅡ來(lái)抑制ESCC進(jìn)程并抑制EMT發(fā)生[52]。最近發(fā)現(xiàn)，miR-32通過(guò)CXXC5介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)抑制作用促進(jìn)ESCC轉(zhuǎn)移過(guò)程[53]。

食管癌組織中異常表達(dá)的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白與TGF-β信號(hào)通路之間的相互作用可以促進(jìn)ESCC的進(jìn)展。在神經(jīng)元遷移中起關(guān)鍵作用的Reelin負(fù)調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞遷移。TGF-β通路通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Snail抑制Reelin的表達(dá)[54]。Fascin是一種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞膜突起，通過(guò)TGF-β通路調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)和富半胱氨酸肝素結(jié)合蛋白61(cysteine-rich protein 61,CYR61)的水平，來(lái)促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和侵襲[55]。CYR61和CTGF的過(guò)表達(dá)與ESCC生存不良有關(guān)[56]。Ezrin是一種細(xì)胞骨架交聯(lián)蛋白，也通過(guò)TGF-β和MAPK信號(hào)通路促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖和侵襲[57]。上述研究結(jié)果表明，TGF-β信號(hào)可以在癌變前期抑制腫瘤的發(fā)生，在癌變的后期促進(jìn)食管癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

5 展望

TGF-β通路在癌癥進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而且是公認(rèn)的抗轉(zhuǎn)移治療的靶點(diǎn)。目前的臨床試驗(yàn)集中于TGF-β活化阻斷劑、配體抑制物、針對(duì)TGF-β受體相互作用的中和抗體、反義寡核苷酸、TGF-β受體激酶活性的抑制劑等。然而，由于TGF-β腫瘤抑制作用取決于細(xì)胞微環(huán)境的變化，影響細(xì)胞因子復(fù)合物的功能，TGF-β信號(hào)作為一種治療策略必須慎重處理。