程艷麗，郝國(guó)平，王曉歡，陸海燕，王麗，王靜

(山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030013)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是小兒最常見(jiàn)的出血性疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚黏膜出血，重癥可表現(xiàn)為內(nèi)臟出血而危及生命。ITP兒童大部分呈自限過(guò)程，但仍有10%～20%患兒轉(zhuǎn)為慢性。由于缺乏特異性診斷指標(biāo)，目前臨床上仍然是排除性診斷[1]。研究表明[2]，血小板抗體的形成是本病的主要發(fā)病機(jī)制之一，其中血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GP Ⅱb/Ⅲa)和血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ(GPⅠb/Ⅸ)是ITP最常見(jiàn)的抗原靶位，75.0%的血小板抗原都位于此兩種復(fù)合體上[3]，而二者導(dǎo)致血小板破壞的途徑不盡相同，對(duì)治療的反應(yīng)也不盡相同，故早期了解ITP患者的血小板抗體類型對(duì)于治療及預(yù)后有關(guān)鍵性作用。本文主要就血小板特異性抗體在急性及慢性ITP患者中檢測(cè)的意義及其與療效和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年6月—2018年6月收治的ITP患者81 例，診斷和分期符合文獻(xiàn)[1]。其中急性ITP患者56 例(急性ITP組)，年齡2個(gè)月～14 歲，男36 例，女20 例；持續(xù)性/慢性ITP患者25 例(持續(xù)性/慢性ITP組)，年齡2～14 歲，男13 例，女12 例；另選擇同期住院非ITP血小板減少患者30 例(非ITP血小板減少組)及同期兒童保健科健康對(duì)照者30 例(健康對(duì)照組)。測(cè)定4組血小板相關(guān)抗體(PAIgA，PAIgG和PAIgM)、血小板特異性抗體(GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ)，分析其臨床意義。各組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審查同意，獲得監(jiān)護(hù)人知情同意(大于8 歲的患者同時(shí)取得本人同意)。

1.2 方法

1.2.1 血小板相關(guān)抗體及血小板特異性抗體的檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀(FCM)(BD公司)檢測(cè)：采患兒晨起空腹血5 mL(EDTA抗凝)，離心分離富血小板血漿(PRP)，繼續(xù)高速離心，棄上清，破壞紅細(xì)胞，取上清0.5 mL加入Eppengorf管中備檢。血小板相關(guān)抗體采用FCM根據(jù)前向散射與側(cè)向角散射設(shè)定血小板門，采集5 000～10 000個(gè)血小板，測(cè)定熒光標(biāo)記陽(yáng)性的血小板百分率。血小板特異性抗體采用單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原(MAIPA)技術(shù)并加以改進(jìn)，檢測(cè)血小板特異性抗體抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPⅠb/Ⅸ，試劑由蘇州醫(yī)學(xué)院(江蘇省血研所)提供。

1.2.2 治療方法

所有ITP患者均選擇靜脈用免疫球蛋白(IVIG)1 g·kg-1·d-1，靜脈滴注，治療1天，或IVIG(用法同前)+糖皮質(zhì)激素治療(醋酸潑尼松2 mg·kg-1·d-1，分2 次口服，6 周內(nèi)逐漸減停) 。持續(xù)性/慢性ITP患者經(jīng)IVIG+激素治療無(wú)效時(shí)，選擇以下方案：第一，重組人血小板生成素(TPO)300 U·kg-1·d-1，皮下注射，治療14 d；第二，地塞米松0.6 mg·kg-1·d-1，分2 次靜脈滴注或口服，每月1 次，共4～6次；第三，長(zhǎng)春地辛 3.0 mg/m2，每周1 次，靜脈推注，連用4～6 周；第四，環(huán)孢素A口服液 2～3 mg·kg-1·d-1，分兩次口服，共3～6 個(gè)月；第五，脾切除。

1.2.3 療效評(píng)估方法

根據(jù)張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[4]，療效評(píng)估如下。顯效：外周血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)正常，持續(xù)3個(gè)月以上無(wú)出血癥狀，維持2 年以上無(wú)復(fù)發(fā)者；良效：外周血小板升至50×109/L或較原來(lái)水平上升30×109/L，無(wú)或基本無(wú)出血癥狀，持續(xù)2個(gè)月以上；有效：外周血小板計(jì)數(shù)有所上升，出血癥狀改善，持續(xù)2 周以上；無(wú)效：外周血小板計(jì)數(shù)及出血癥狀無(wú)改善或惡化?？傆行?%)=(顯效+良效)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

對(duì)4組患者血小板相關(guān)抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；對(duì)4組患者血小板特異性抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；對(duì)急性ITP組患者血小板特異性抗體檢測(cè)陽(yáng)性率、療效及病情轉(zhuǎn)歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 4 組患兒血小板相關(guān)抗體檢測(cè)結(jié)果比較

4組患兒均可以檢出血小板相關(guān)抗體，其中健康對(duì)照組抗體表達(dá)水平較低，與其他三組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而急性ITP、慢性/持續(xù)性ITP、非ITP血小板減少三組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示血小板相關(guān)抗體診斷ITP特異性較低(見(jiàn)表1)。

表1 4 組血小板相關(guān)抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 4 組患兒血小板特異性抗體檢測(cè)結(jié)果比較

ITP組(包括急性ITP、持續(xù)性/慢性ITP)與非ITP血小板減少組和健康對(duì)照組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示血小板特異性抗體抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPⅠb/Ⅸ對(duì)診斷免疫性血小板減少癥特異性強(qiáng)，但敏感性較低(見(jiàn)表2)。

表2 4組血小板特異性抗體檢測(cè)結(jié)果比較 例(%)

2.3 4組患兒療效及預(yù)后比較

急性ITP患者血小板特異性抗體抗GPⅡb/Ⅲa的檢出率明顯高于抗GPⅠb/Ⅸ，且抗體的類型與患者的預(yù)后明顯相關(guān)?？笹PⅡb/Ⅲa陽(yáng)性的患者IVIG/IVIG+糖皮質(zhì)激素治療總有效率高達(dá)86.7%，而抗GPⅠb/Ⅸ陽(yáng)性ITP患者治療總有效率只有33.3%，兩個(gè)抗體雙陽(yáng)性患者治療總有效率更低(僅20.0%)。而抗GPⅡb/Ⅲa及抗GPⅠb/Ⅸ抗體雙陰性患者IVIG/IVIG+糖皮質(zhì)激素治療總有效率高達(dá)92.0%。且經(jīng)隨訪發(fā)現(xiàn)抗GPⅡb/Ⅲa陽(yáng)性患者轉(zhuǎn)為慢性ITP比例僅占13.3%，而抗GPⅠb/Ⅸ陽(yáng)性患者轉(zhuǎn)為慢性ITP的比例高達(dá)66.7%。4組療效及轉(zhuǎn)為慢性所占比例比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示GPⅠb/Ⅸ抗體陽(yáng)性患者對(duì)糖皮質(zhì)激素及IVIG治療不敏感，臨床療效差，且易轉(zhuǎn)為持續(xù)性/慢性ITP(見(jiàn)表3)。

表3 急性ITP患者不同型別血小板特異性抗體與療效的關(guān)系與轉(zhuǎn)歸 例(%)

3 討 論

ITP作為一種免疫性疾病，目前認(rèn)為存在未知遺傳易感背景，在感染等促發(fā)因素作用下，自身免疫發(fā)生異常，導(dǎo)致血小板抗體產(chǎn)生[5]，這是其發(fā)病的主要機(jī)制之一。血小板抗體主要分兩大類，一類主要是針對(duì)人類組織相容性抗原(HLA)Ⅰ類為抗原靶位的抗體，即血小板表面相關(guān)抗體(包括PAIgG，PAIgM，PAIgA)，特異性較差，因?yàn)槌“逋?，HLAⅠ類抗原也表達(dá)于其他細(xì)胞表面或組織上。早期研究認(rèn)為血小板相關(guān)抗體在ITP患者中都有不同程度的升高，但在非ITP患者甚至健康人群中也可以檢出，故1996年美國(guó)血液學(xué)會(huì)建議：診斷ITP時(shí)，檢測(cè)血小板相關(guān)抗體是不恰當(dāng)和不需要的，此后其在ITP中的診斷價(jià)值逐漸被人們否定[6]。另一類抗體是針對(duì)血小板膜糖蛋白(GP)的抗體，與前者相比特異性強(qiáng)，又稱血小板特異性抗體，據(jù)其抗原靶位不同分為抗GPⅡb/Ⅲa抗體、抗GP Ib/Ⅸ抗體、抗GPⅠa/Ⅱa抗體、抗GPⅣ抗體、抗CD31抗體等[7]。其中約有75%的血小板抗原都位于GPⅡb/Ⅲa或GP Ib/Ⅸ上，且除這兩種常見(jiàn)的抗體外，其他血小板特異性抗體對(duì)血小板數(shù)量影響不大。本文主要探討血小板相關(guān)抗體及特異性抗體的檢測(cè)在ITP發(fā)病中的意義，結(jié)果顯示血小板相關(guān)抗體在ITP、非ITP血小板減少患者中均可以檢出，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甚至在健康人群也有一定檢出率，提示血小板相關(guān)抗體PAIgG，PAIgA及PAIgM對(duì)ITP診斷缺乏特異性。而血小板特異性抗體在ITP、非ITP血小板減少癥患者及健康人群中檢出率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血小板特異性抗體GPⅡb/Ⅲa及抗GP Ib/Ⅸ對(duì)免疫性血小板減少癥診斷有特異性，但非100%陽(yáng)性率，可能與檢測(cè)方法敏感性及部分ITP患者可能存在其他血小板特異性抗體有關(guān)。研究表明不同的血小板特異性抗體表達(dá)導(dǎo)致的ITP患者臨床出血嚴(yán)重程度、對(duì)治療的敏感性及預(yù)后均有不同?？笹PⅡb/Ⅲa陽(yáng)性者臨床出血癥狀輕，而GP Ib/Ⅸ抗體陽(yáng)性或雙陽(yáng)性患者出血癥狀重。GPⅡb/Ⅲa抗體主要通過(guò)Fc途徑導(dǎo)致血小板減少，而抗GP Ib/Ⅸ是非依賴Fc途徑的，故GPⅡb/Ⅲa抗體陽(yáng)性者對(duì)IVIG、激素治療敏感，而GP Ib/Ⅸ抗體陽(yáng)性或兩種抗體雙陽(yáng)性者對(duì)IVIG及激素治療僅部分有效[8]。且研究表明慢性或持續(xù)性ITP患者中抗GP Ib/Ⅸ表達(dá)高，提示GP Ib/Ⅸ抗體陽(yáng)性患者預(yù)后相對(duì)差，易發(fā)生慢性/持續(xù)性ITP(C/RITP)。本研究結(jié)果也顯示，抗GPⅡb/Ⅲa陽(yáng)性患者治療總有效率明顯高于抗GP Ib/Ⅸ陽(yáng)性患者，而在慢性/持續(xù)性ITP患者中后者的檢出率更高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。所以在臨床工作中通過(guò)檢測(cè)血小板特異性抗體的類別可以預(yù)估患者療效，且對(duì)治療有一定的指導(dǎo)意義。對(duì)抗GP Ib/Ⅸ陽(yáng)性患者避免多次反復(fù)IVIG及激素治療，以減少患者的家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及避免激素的不良反應(yīng)。

近年對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制的研究也有了許多突破性進(jìn)展。許多學(xué)者認(rèn)為ITP患者尤其C/RITP患者存在復(fù)雜的細(xì)胞免疫網(wǎng)絡(luò)異常，除自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞以外，其發(fā)病機(jī)制的進(jìn)展還包括以下方面：第一，CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs細(xì)胞)缺失導(dǎo)致功能異常，釋放促進(jìn)免疫活化的細(xì)胞因子，刺激B淋巴細(xì)胞發(fā)育增殖，從而促發(fā)抗體介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)[5，10]。第二，樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)—共刺激信號(hào)/細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)和自然殺傷(NK)細(xì)胞異常，T和B淋巴細(xì)胞寡克隆增殖及B淋巴細(xì)胞激活因子異常等[11]，導(dǎo)致免疫功能失調(diào)促發(fā)自身免疫反應(yīng)。第三，F(xiàn)c-非依賴性血小板清除途徑：目前發(fā)現(xiàn)抗GP Iba抗體可引起血小板表面糖蛋白發(fā)生去唾液酸化，去唾液酸化的血小板被肝細(xì)胞表面的AMR識(shí)別，并被Kupffer細(xì)胞吞噬，血小板減少是通過(guò)Fc-非依賴途徑完成的，且破壞血小板的主要場(chǎng)所在肝臟而非脾臟，故GP Iba抗體陽(yáng)性ITP患者對(duì)IVIG、糖皮質(zhì)激素及脾切除治療均反應(yīng)不佳[12]。這種Fc-非依賴性的血小板減少在抗GP Iba抗體介導(dǎo)的ITP動(dòng)物模型中可以成功被2-脫氧-2，3-雙脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)所糾正[13]。第四，血小板抗原表位漂移機(jī)制，產(chǎn)生針對(duì)新生血小板抗原的抗血小板抗體。第五，已有報(bào)道稱“泵”上調(diào)可將細(xì)胞內(nèi)的治療分子外排，證明了另一種可能產(chǎn)生藥物抵抗的機(jī)制。用環(huán)孢菌素治療可使膜重新極化，并可以逆轉(zhuǎn)某些淋巴細(xì)胞泵的活性[14]。第六，以上各種引發(fā)ITP的機(jī)制除導(dǎo)致血小板破壞增多外，還影響巨核細(xì)胞成熟障礙，從而導(dǎo)致血小板生成減少。除此之外對(duì)于難治性ITP患者要再認(rèn)識(shí)及再評(píng)估，研究發(fā)現(xiàn)C/RITP中有15%可能系遺傳性血小板減少，還有部分可能演變?yōu)楣撬柙錾惓＞C合征(MDS)或骨髓衰竭性疾病。針對(duì)以上新的發(fā)病機(jī)制也嘗試了一些新的治療ITP的藥物如：rhTPO，TPO-RAs及利妥苷單抗或抗CD20單抗、神經(jīng)胺酸酶抑制劑(奧司他韋)[15]、環(huán)孢素A等，取得明顯療效。也有越來(lái)越多的新藥被引入臨床試驗(yàn)，包括抗CD40配體(BMS．986004)、脾酪氨酸激酶抑制劑(福他替尼)以及一些“老藥新用”的藥物(如地西他濱、西羅莫司、沙利度胺)等。但對(duì)于C/RITP患者發(fā)病機(jī)制可能并非單一，單一的藥物治療效果并不樂(lè)觀，針對(duì)不同機(jī)制的聯(lián)合用藥如何能達(dá)到最佳效果仍然是我們今后努力探索的方向。未來(lái)我們還需要進(jìn)一步尋找ITP患者新的生物學(xué)標(biāo)記，希望通過(guò)各種生物學(xué)標(biāo)記指導(dǎo)臨床合理精準(zhǔn)的治療，進(jìn)一步提高ITP尤其是C/RITP患者的療效以及生活質(zhì)量。