范恒瑞，宋明宇，邱 瑾，吳 迪

(3M中國有限公司，北京 大興 100176)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，本病最易感染的動物包括牛、豬、羊等?？谔阋咴趤喼蕖⒎侵?、中東和南美均有流行，發(fā)病率極高，傳播速度極快。世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類人獸共患病首位，要求成員國將口蹄疫列入必須報告動物疾病的名錄中[1]。疫苗接種是特異性預(yù)防FMD的有效手段。FMD滅活疫苗由完整病毒經(jīng)過滅活劑滅活后制成，在預(yù)防和控制FMD的過程中發(fā)揮著重要作用[2]。

FMDV本身抗原性較差，病毒滅活后對其抗原的影響較大，所以現(xiàn)階段口蹄疫疫苗生產(chǎn)中，高純度的口蹄疫疫苗能保證單位使用劑量中抗原含量和純度，這顯得尤為重要，也是目前疫苗接種的策略。這對于病毒的下游純化提出了很高的要求。另外，2009年以前，國內(nèi)滅活口蹄疫疫苗上游多為采用轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)方式，隨著對于疫苗需求的提升，該培養(yǎng)方式需大量轉(zhuǎn)瓶、效率低下、表達(dá)量低的弊端逐漸顯現(xiàn)。因此，近年來細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)由以往的貼壁培養(yǎng)慢慢向懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)變，病毒產(chǎn)量得到了顯著提高[3]。然而，隨著病毒產(chǎn)量的提高，培養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，給下游純化帶來更大的壓力，因為伴隨培養(yǎng)過程產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、細(xì)胞釋放宿主蛋白、宿主DNA等相應(yīng)也劇增，這對于下游純化的能力提出了進(jìn)一步的要求。

膜過濾技術(shù)廣泛應(yīng)用于疫苗等生物制品的生產(chǎn)過程中，其中直流過濾技術(shù)通常應(yīng)用于病毒液的收獲過程，用以分離細(xì)胞碎片等不溶性雜質(zhì)。早期的FMDV澄清主要采用以折疊膜濾芯為代表的表面過濾技術(shù)；隨著培養(yǎng)條件的變化，細(xì)胞碎片雜質(zhì)的增多，表面過濾難以達(dá)到澄清效果，而且由于表面過濾載量較低，濾材成本也越來越高。在上述背景下，深層過濾在FMDV的胞液分離過程得到越來越多的應(yīng)用。深層過濾濾材通常由天然來源的長細(xì)纖維構(gòu)成，過濾介質(zhì)成膜后形成的通道往往都十分曲折，類似迷宮式的孔徑結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)顆粒往往在濾材內(nèi)部而非表面被截留捕捉。而且，過濾通道壁面往往會以靜電作用或者分子間作用力的方式吸附一部分極其細(xì)小的顆粒雜質(zhì)?？傮w而言，深層過濾的過濾機(jī)理表現(xiàn)為機(jī)械截留和吸附作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液BHK21 懸浮培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù)流離心工藝離心上清液。

1.2 主要儀器 2100Q便攜式濁度儀，哈希公司產(chǎn)品；蠕動泵，Cole Parmer公司產(chǎn)品；47 mm過濾夾持器，3M公司產(chǎn)品；Zeta PlusTM深層過濾濾材，型號:60SP、60ZB、30SP、30ZB，3M公司產(chǎn)品。

1.3 恒流過濾方法 安裝深層濾板至恒流過濾裝置，用緩沖液PBS沖洗濾板54 L/m2以上；沖洗完畢后啟動蠕動泵緩慢泵入料液，緩慢調(diào)節(jié)泵速至約預(yù)計流速，進(jìn)行料液過濾；記錄過濾過程濾出體積、時間、壓差、濁度。收集濾出液進(jìn)行抗原檢測。

2 結(jié)果

2.1 深層過濾的優(yōu)勢 表面過濾是通過濾材表面對顆粒進(jìn)行捕捉截留來實現(xiàn)過濾的技術(shù)。過濾機(jī)理主要是依據(jù)流體中顆粒大小進(jìn)行篩分，大顆粒被截留在濾膜表面。深層過濾利用內(nèi)部通道，在深度進(jìn)行顆粒攔截以及吸附[4]。二者對比示意圖如圖1所示。

圖1 深層過濾和表面過濾[5]

取某廠家的口蹄疫疫苗滅活液，分別采用0.45 μm 孔徑的聚丙烯材質(zhì)表面膜和深層濾板進(jìn)行預(yù)過濾去除細(xì)胞碎片，然后再用0.2 μm孔徑的除菌過濾器進(jìn)行過濾?？蔀V性數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液深層過濾和表面過濾可濾性測試對比

該口蹄疫疫苗滅活液濁度為77 NTU，如果直接進(jìn)行除菌過濾，大量細(xì)胞碎片勢必造成0.2 μm濾膜很快堵塞，進(jìn)而影響146S病毒粒子的透過性。因此，在除菌過濾之前設(shè)計了預(yù)過濾，并且對比了深層過濾和表面過濾這2種預(yù)過濾方式。選取雙層深層濾板30ZB+60ZB進(jìn)行過濾，載量641 L/m2，深層過濾將77 NTU的物料降低至9.65 NTU，澄明透亮；而0.45 μm的表面過濾載量僅僅46 L/m2，濾出液濁度高達(dá)41 NTU，不適合作為預(yù)過濾。從后續(xù)0.2 μm 除菌過濾的載量對比上可見，深層過濾后除菌濾膜載量為655 L/m2，是對應(yīng)表面過濾后除菌過濾載量(僅91 L/m2)的7.2倍。

146S檢測結(jié)果表明，深層過濾系統(tǒng)收率整體高于表面過濾系統(tǒng)。深層過濾載量是表面過濾的13.9倍，濾出液濁度僅為表面過濾的23.5%，后續(xù)0.2 μm除菌過濾載量是表面過濾的7.2倍。因此，無論從成本角度還是從收率角度考慮，深層過濾系統(tǒng)都明顯優(yōu)于表面膜過濾系統(tǒng)。

2.2 強(qiáng)正電荷深層濾器的優(yōu)勢 針對不同來源的口蹄疫疫苗滅活液，采用正電荷深層濾板和強(qiáng)正電荷深層濾板進(jìn)行對比測試?？蔀V性結(jié)果如表2所示，過濾過程濾速壓差變化如中插彩版圖2所示。

表2 口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液強(qiáng)正電荷深層過濾可濾性參數(shù)

所采用的兩組深層濾板具有一樣的孔徑精度，從載量、壓差變化等角度看，表現(xiàn)非常一致，中插彩版圖2中壓差變化曲線也基本重合。但是從濾出液濁度來看，差異很大。普通正電荷的30SP+60SP雙層濾板的濾出液25 NTU，而同樣孔徑的強(qiáng)正電荷深層濾板30ZB+60ZB雙層濾板的濾出液僅9.65 NTU，僅為普通深層濾板的38.6%。這主要得益于強(qiáng)正電荷深層濾板濾材中特殊的樹脂配基。通過強(qiáng)正電荷雙層濾板，濁度降低至10 NTU以下，細(xì)胞碎片被充分吸附或者截留，有利于后續(xù)超濾或者除菌過濾工藝。除了對于不可溶性的細(xì)胞碎片有吸附作用，Yigzaw Y等[6]還曾報道過強(qiáng)正電荷深層濾板對于細(xì)胞宿主蛋白的去除作用，Dorsey N等[7]報道過強(qiáng)正電荷深層濾板對于DNA的去除作用。

2.3 深層過濾對口蹄疫疫苗上清液的澄清過濾工藝建立 通過上述表面過濾和深層過濾的對比研究、特殊的強(qiáng)正電荷深層濾板澄清效果的研究，針對不同培養(yǎng)條件產(chǎn)生的口蹄疫疫苗滅活上清液，應(yīng)該給予匹配不同的過濾方案。低濁度、中等濁度、高濁度3種不同濁度的離心上清液，深層過濾方案及相應(yīng)過濾參數(shù)如表3所示。

表3 不同濁度口蹄疫疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液的過濾方案

對于較低濁度的離心上清，單層深層濾板可以有效澄清，去除少量的細(xì)胞碎片；對于中等濁度的離心上清，雙層深層濾板可以有效澄清，尤其是強(qiáng)正電荷的Zeta PlusTMZB系列濾板可以將濁度降低至5 NTU以下；對于較高濁度的離心上清，SP及ZB的組合濾板可以有效澄清。無論哪一種工藝，處理量均在500～800 L/m2，濾出液濁度均低于20 NTU，目標(biāo)抗原均完全回收，適合規(guī)?；a(chǎn)。

3 討論

20世紀(jì)70年代，過濾介質(zhì)被規(guī)定不得采用石棉材料，因為石棉材料中存在致癌物質(zhì)。后來，科學(xué)家Cuno發(fā)明了Zeta PlusTM濾材，該濾材不含有石棉，但有更強(qiáng)的正電荷。該濾材由木質(zhì)纖維基體和助濾劑混制而成，生產(chǎn)過程中利用高分子樹脂連接基本成分，其中的正電荷功能基團(tuán)有效賦予了深層濾材電荷吸附的能力。Hou K等[8]報道了Zeta PlusTM吸附型深層過濾在細(xì)小顆粒的捕捉能力上的優(yōu)異表現(xiàn)，如圖3所示。

圖3 深層過濾介質(zhì)靜電吸附/機(jī)械攔截示意圖[4,8]

本試驗選取不同樹脂成分、不同精度的Zeta PlusTM濾材對FMDV培養(yǎng)液進(jìn)行澄清過濾測試，并與表面過濾進(jìn)行對比測試。結(jié)果顯示，深層過濾相對于表面過濾更加適合于細(xì)胞碎片的去除，有利于后續(xù)微生物負(fù)荷控制過濾單元(0.2 μm)。另外，通過對比強(qiáng)正電荷深層濾板和普通正電荷深層濾板的過濾效果，強(qiáng)正電荷的Zeta PlusTMZB系列濾板顯示了極強(qiáng)的濁度控制能力，可以將濁度降低至5 NTU 以下，非常有利于提高整個過濾工藝的穩(wěn)健性。

上游培養(yǎng)工藝對于有效成分收獲步驟的影響巨大，本試驗通過測試最終建立了針對不同濁度的細(xì)胞培養(yǎng)液的可規(guī)?；倪^濾方案，對于大規(guī)模生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。