馬冰雪，羅成飛，代翠紅

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院)

0 前言

甜菜色素普遍存在于石竹目中，是一類水溶性的含氮植物色素，系毗嚨類衍生物，因最早提取于甜菜而得名，均是由石竹目屬(除石竹科和粟米草科)的植物產(chǎn)生[1-2]。

甜菜色素分為兩大類：甜菜紅素和甜菜黃素。其中前者是生色基團(tuán)甜菜醛氨酸(betalamicacid,BA)與環(huán)狀多巴(cyclo-DOPA)縮合之后的產(chǎn)物，而后者則是甜菜醛氨酸與胺類或氨基酸類反應(yīng)的產(chǎn)物。甜菜紅素是紅甜菜的主要色素，主要成分為甜菜紅苷。黃色和紫紅色的甜菜色素一般僅存在于石竹目中，其生物學(xué)作用與花青素類似。目前甜菜色素和花青素從未在兩個(gè)不同植物中發(fā)現(xiàn)。兩者是否有進(jìn)化過程中的排斥現(xiàn)象至今仍未有正確解釋；然而，已經(jīng)被證實(shí)的是，在生化水平上，在產(chǎn)生甜菜紅素的植物中關(guān)于花青素合成的酶并不表達(dá)[3]。此外，與甜菜紅素相關(guān)的色素在真菌中也有研究[4]。一定程度上，相似色素在植物中和真菌中的共同存在意味著其在甜菜色素生物合成關(guān)鍵酶的進(jìn)化上趨同。

1 材料與方法

1.1 植物材料

食用紅甜菜品種：工大食甜1號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜幼苗不同化感物質(zhì)處理下的培養(yǎng)

1.2.2 化感物質(zhì)的獲得

本實(shí)驗(yàn)中的供試秋葵，大豆，玉米，菊苣、甜菜的殘根系來自糖業(yè)研究所試驗(yàn)田。選取成熟干燥未腐爛莖、根實(shí)驗(yàn)原料于烘箱中烘干，粉碎至 2-5 cm 左右。將各作物粉碎后分別以 1∶30(質(zhì)量g：體積 ml)在30℃下浸提72 h靜置過濾，除去殘?jiān)@得浸提液[5]。

1.2.3 發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

種子前處理階段完全按照“GB19176-2010”的方法，4次重復(fù)6個(gè)處理(秋葵、大豆、玉米、菊苣、甜菜的浸提液,對(duì)照為水)。發(fā)芽溫度在設(shè)置為24℃，光照強(qiáng)度為5 000 lx，光照時(shí)間8H，試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為10 d。初次計(jì)數(shù)時(shí)間為4 d，之后隔天計(jì)數(shù)，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為10 d，均以正常幼苗數(shù)計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)果以粒數(shù)的百分率表示[6]。

種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù)(VI)以及對(duì)化感作用效應(yīng)指數(shù)(RI) 可以通過下列公式計(jì)算：發(fā)芽勢(shì)(%)=前4天種子發(fā)數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽率(%)=前7天種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt；活力指數(shù)(VI)=GI×S。式中，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，S為幼苗的生長勢(shì)(芽長度)，本次數(shù)據(jù)處理采用的芽長度為第10 d最后一次記錄時(shí)的出芽長度?；凶饔眯?yīng)指數(shù)(RI)計(jì)算公式如下：RI=1-C/T，其中C為對(duì)照值，T為處理值，RI>0時(shí)為促進(jìn)作用，RI<0時(shí)為抑制作用，絕對(duì)值的大小代表作用強(qiáng)度的大小[7]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel、SPSS軟件處理分析。

1.2.4 不同光質(zhì)下甜菜幼苗的培養(yǎng)與處理

本實(shí)驗(yàn)在不同顏色冷光質(zhì)下，對(duì)甜菜進(jìn)行了培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25℃，光照時(shí)間16 h/d。不同光質(zhì)處理為：自然光、藍(lán)、綠、紅(電壓：220 V，功率：14 W)共4個(gè)處理方式。在播種后的第7 d進(jìn)行第一次的取樣，之后每隔7 d進(jìn)行取樣，共取樣5次，每次必須保證隨機(jī)選取，選取10株幼苗進(jìn)行鮮重，株高，葉面積等生理指標(biāo)的測(cè)量。同時(shí)，對(duì)每一時(shí)期的幼苗進(jìn)行取樣凍存(液氮取樣，-80℃凍存)用以檢測(cè)甜菜UDP及TYR 基因不同時(shí)期的表達(dá)量。

1.2.5 甜菜紅素的提取與測(cè)定

以上述不同處理?xiàng)l件下不同時(shí)期的甜菜苗為樣品，稱取0.1 g甜菜新鮮組織，液氮中進(jìn)行研磨。研磨完迅速加入1.6 mL預(yù)冷甲醇，劇烈振蕩混勻。于4℃放置30 min，離心10 min去上清，用雙蒸水重懸沉淀，4℃ 30 min，12 000 r/min離心取上清。用紫外分光光度計(jì)在536 nm下測(cè)吸光值。根據(jù)甜菜紅素的摩爾吸光系數(shù)5.66×104計(jì)算甜菜紅素的絕對(duì)含量[8]。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

按照SYBR?Premix Ex Taq II試劑盒說明進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)儀器ABI 7300熒光定量PCR儀，使用試劑SYBR?Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)，方法參照試劑盒說明書，每個(gè)樣進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)。根據(jù)NCBI提供的甜菜基因序列進(jìn)行基因序列比對(duì)，根據(jù)結(jié)果中保守區(qū)的核苷酸序列，采用生物學(xué)軟件Primier5.0設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因?yàn)锽vICDH。

每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物重復(fù)和2次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化感物質(zhì)對(duì)甜菜發(fā)芽的影響

由表1可知，5種化感物質(zhì)對(duì)甜菜種子萌發(fā)的影響不同。其中甜菜化感物質(zhì)的抑制作用最強(qiáng)，在其處理下，甜菜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均明顯低于對(duì)照，RI值均為負(fù)值，這一現(xiàn)象也說明了甜菜對(duì)自身的生長有一定的毒性，與已經(jīng)報(bào)道的甜菜連作障礙相一致；在菊苣化感物質(zhì)的處理?xiàng)l件下，甜菜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)低于對(duì)照，而活力指數(shù)高于對(duì)照，說明菊苣化感物質(zhì)雖然對(duì)甜菜種子的萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)，但其反而促進(jìn)了甜菜幼苗的株高，所以其活力指數(shù)的RI值轉(zhuǎn)為正值。對(duì)甜菜種子萌發(fā)表現(xiàn)出促進(jìn)作用的為秋葵、玉米、大豆化感物質(zhì)，三種物質(zhì)中，促進(jìn)作用從大到小依次是大豆，秋葵，玉米，甜菜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均高于對(duì)照。

表1 不同化感物質(zhì)對(duì)甜菜幼苗發(fā)芽率的影響

玉米和對(duì)照組的長勢(shì)明顯最好，大豆，秋葵的長勢(shì)次之，菊苣，甜菜的長勢(shì)最差，菊苣和甜菜化感物質(zhì)的抑制作用很明顯，根系的生長受到了嚴(yán)重的抑制，尤其是在甜菜化感物質(zhì)的處理下的根系影響最大。

2.2 不同化感物質(zhì)對(duì)甜菜生理指標(biāo)的影響

如圖1所示，隨著幼苗的生長，鮮重均在一直增加。秋葵、玉米、大豆化感物質(zhì)均對(duì)甜菜幼苗鮮重的增長有促進(jìn)作用，其中玉米的促進(jìn)作用最為明顯，該結(jié)果與上述發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致，菊苣、甜菜化感物質(zhì)抑制了幼苗根部的生長，進(jìn)而抑制了其鮮重的增長。甜菜化感物質(zhì)對(duì)自身仍有明顯的抑制作用。

圖1 不同化感物質(zhì)對(duì)甜菜幼苗鮮重的影響

圖2 不同化感物質(zhì)對(duì)幼苗株高的影響

如圖3可知，在不同化感物質(zhì)的處理下，甜菜紅素含量呈現(xiàn)出不同的表現(xiàn)。在秋葵、菊苣、甜菜、大豆化感物質(zhì)的處理下，色素含量在最初的子葉時(shí)期穩(wěn)步增加直到四葉期，之后增速變慢，甚至甜菜化感物質(zhì)下的色素含量出現(xiàn)了小幅的下降。玉米化感物質(zhì)下，幼苗在初期表現(xiàn)出了最高的色素含量，之后開始下降，直到四葉期，四葉期到六葉期后開始趨于平穩(wěn)。

圖3 不同化感物質(zhì)對(duì)甜菜幼苗甜菜紅素含量的影響

說明經(jīng)過處理后的幼苗甜菜紅素含量均明顯高于對(duì)照組，表明雖然甜菜化感物質(zhì)對(duì)自身的發(fā)芽率及長勢(shì)有負(fù)面影響，但其化感物質(zhì)也促進(jìn)了甜菜紅素的合成，可以對(duì)各個(gè)處理組的化感物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離、純化等，找到具體原因，從而對(duì)甜菜紅素生物合成途徑進(jìn)行進(jìn)一步的了解[9]。此外，我們可以發(fā)現(xiàn)，甜菜幼苗的四葉期均是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，色素含量到四葉期后均會(huì)趨于平穩(wěn)。

2.3 不同光質(zhì)對(duì)甜菜生理指標(biāo)的影響

如圖4，可以得到，綠光、藍(lán)光、紅光均會(huì)對(duì)幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用，紅光的抑制作用最為明顯，鮮重的變化幅度極小，幾乎生長停滯。綠光和藍(lán)光相比，抑制作用差別不大，綠光的抑制作用更強(qiáng)。儲(chǔ)鐘稀等人用自然光、紅光和藍(lán)光培養(yǎng)的黃瓜發(fā)現(xiàn)：3種光中，紅光培養(yǎng)下的葉片紅光下的葉片具有較高的光系統(tǒng)II(PS II)活性和較低的光系統(tǒng)I(PS I)活性，光合放O2速率最高，但植株生長得最慢；藍(lán)光下的葉片具有較低的PS II活性和較高的PS I活性，放O2速率最低且葉綠素含量最低，但有利于植株生長，其株高和葉面積均比紅光和自然光要高[10]。結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 不同光質(zhì)對(duì)甜菜幼苗鮮重的影響

但是，經(jīng)研究表明，不同光質(zhì)對(duì)植物的影響效應(yīng)不盡相同，甚至得出相反的結(jié)論。不能籠統(tǒng)地認(rèn)為“某種光的光合作用強(qiáng)，某種光的光合作用弱”，有研究表明， 大豆和玉米在自然光下生長得最快，紅光次之，藍(lán)光下生長的則最慢，說明光質(zhì)對(duì)植物的影響與植物種類有關(guān)[11]。此外，研究表明，綠光會(huì)抑制氣孔的張開，而藍(lán)光和紅光則表現(xiàn)出促進(jìn)作用。每種光質(zhì)對(duì)于植物生長的影響方面有較大的差異，研究表明，紅光加快了光合產(chǎn)物的積累；藍(lán)光可以有效促進(jìn)葉綠體的發(fā)育，紅、藍(lán)、綠的三色復(fù)合光有利于葉面積的擴(kuò)展。大多數(shù)的高等植物不同光質(zhì)下的光合速率為橙、紅光大于藍(lán)紫光大于綠光[66]。因此光質(zhì)對(duì)光合作用的影響機(jī)理是錯(cuò)綜復(fù)雜的，要想徹底搞清楚這些問題還需要更進(jìn)一步的深入研究。

如圖5，可以得到，綠光、藍(lán)光、紅光均會(huì)對(duì)幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用，紅光的抑制作用最為明顯，生長幾乎停滯。綠光和藍(lán)光相比，抑制作用差別不大，藍(lán)光的抑制作用更強(qiáng)。

圖5 不同光質(zhì)對(duì)甜菜幼苗株高的影響

如圖6，可以得到，綠光、藍(lán)光、紅光均會(huì)對(duì)幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用，綠光和藍(lán)光的抑制作用相當(dāng)。紅光的抑制作用最為明顯，葉面積變化幅度極小，幾乎無變化，葉面積的生長停滯，其引起的光合作用勢(shì)必也無明顯增長，該數(shù)據(jù)也為上述紅光下鮮重及株高的生長停滯帶來了合理的解釋。

圖6 不同光質(zhì)對(duì)甜菜幼苗葉面積的影響

如圖7，在不同的光處理下，色素含量的總體變化趨勢(shì)均為先上升后下降，只是，紅光照射下，下降的拐點(diǎn)在21 d，而藍(lán)、綠、自然光下的幼苗色素下降是在28 d之后開始的。藍(lán)光和自然光處理下色素含量較高，而綠光和紅光下色素含量則明顯偏低。其中藍(lán)光處理中甜菜紅素含量最高，紅光中色素含量最低，藍(lán)光處理下大概是紅光下甜菜紅素含量的5倍左右，這說明短波長有利于色素的積累。

圖7 不同光質(zhì)對(duì)甜菜幼苗色素含量的影響

分別為不同光質(zhì)下播種了14日齡和28日齡時(shí)的甜菜幼苗?？梢钥吹?，紅光下幼苗的生長狀況明顯差于其余三種光，且14日齡和28日齡時(shí)的幼苗變化幅度小。藍(lán)光和綠光下的幼苗生長狀況幾乎相當(dāng)，我們可以看到藍(lán)光下的葉子呈長條形，而綠光下的幼苗葉片相比下更偏向于橢圓形，且隨著時(shí)間的增長，藍(lán)光和綠光下的幼苗長勢(shì)與自然光差距越來越大，自然光下幼苗為四片真葉時(shí)，藍(lán)光、綠光下的幼苗依然處在兩片真葉期。

3 結(jié)論

(1)5種化感物質(zhì)對(duì)甜菜種子萌發(fā)的影響不同。甜菜和菊苣化感物質(zhì)對(duì)甜菜種子萌發(fā)表現(xiàn)出抑制作用，甜菜化感物質(zhì)的抑制作用最強(qiáng)。促進(jìn)作用從大到小依次是大豆，秋葵，玉米。

(2)不同化感物質(zhì)對(duì)甜菜苗的生長影響效果不同，秋葵、玉米、大豆化感物質(zhì)均對(duì)幼苗的鮮重、株高有促進(jìn)作用，菊苣、甜菜化感物質(zhì)則為抑制作用。

(3)化感物質(zhì)對(duì)色素含量及基因表達(dá)產(chǎn)生影響表明其可能在甜菜紅素合成過程中發(fā)揮作用，基因表達(dá)量變化與色素積累量的不一致表明可能還有其他因素影響甜菜色素的合成。UDP及TYR基因的表達(dá)量可能會(huì)由于色素含量的變化產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)。此外，玉米化感物質(zhì)中可能含有某種成分可有效促進(jìn)基因的表達(dá)。

(4)在不同的光質(zhì)處理下，綠光、藍(lán)光、紅光均會(huì)對(duì)幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用，紅光的抑制作用最為明顯。綠光和藍(lán)光的抑制作用差別不大。