羅強(qiáng) 劉杰 劉志剛

摘 要：目的：評(píng)價(jià)醬香型白酒中生物活性物質(zhì)（Bio-active compounds， BAC）抗幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）活性及潛在的作用機(jī)制。方法：BAC處理Hp菌液，觀察Hp的活性及形態(tài)變化。RT-PCR分析BAC對(duì)Hp基因及相關(guān)毒力蛋白的表達(dá)影響。檢測(cè)BAC處理Hp對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1活性、細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：BAC可抑制Hp生長(zhǎng)，但Hp形態(tài)未見明顯改變;BAC可抑制Hp外膜蛋白基因（BabA）和毒力基因（CagA和VacA）的表達(dá);抑制毒力蛋白（CagA和VacA）的表達(dá);BAC可抑制Hp所致的GES-1細(xì)胞活性降低及細(xì)胞凋亡（p<0.05）。結(jié)論：BAC對(duì)Hp有一定的抑制作用，可通過降低Hp外膜蛋白基因（BabA）和毒力基因（CagA和VacA）及毒性蛋白（CagA和VacA）的表達(dá)抑制Hp對(duì)胃上皮細(xì)胞的損傷。

關(guān)鍵詞：醬香型白酒;幽門螺桿菌;外膜蛋白;毒力蛋白

Abstract：Objective： To evaluate the anti-helicobacter pylori （Hp） potency and mechanism of bio-active compounds （BAC） in Maotai flavor liquor. Methods： The activity and the morphological changes of Hp were observed after the co-culture with BAC. RT-PCR was used to evaluate the effect of BAC on the expression of Bab A， CagA and VacA genes. The effect of Hp on the cell viability and apoptosis of gastric mucosal epithelial GES-1 cells was evaluated with CCK8 method and flow cytometry. Results： BAC inhibits the growth of Hp， and inhibits the expression of Bab A， CagA and VacA genes; BAC also attenuates the expression of CagA and VacA proteins; BAC significantly inhibits the decrease of cell viability and cell apoptosis of GES-1 cells induced by Hp infection （p<0.05）. Conclusion： BAC can attenuate Hp induced gastric epithelial cells apoptosis and cell viability decrease by inhibiting the Bab A， Cag A and Vac A expressions.

Key words：Maotai flavor liquor; Helicobacter pylori; CagA; VacA

中圖分類號(hào)：TS262.3

醬香型白酒是我國(guó)重要的白酒香型之一，具有與其他香型的白酒所不同的氣味與口感。醬香型白酒的生產(chǎn)工藝復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)量低，但其具有的獨(dú)特香味受到人們的喜愛。文獻(xiàn)報(bào)到，通過2D-GC-MS技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒中至少含有500多種化合物[1]。眾所周知，過量飲酒會(huì)導(dǎo)致肝臟疾病，但研究發(fā)現(xiàn)，適量飲用醬香型白酒未對(duì)肝臟造成損傷，推測(cè)是醬香型白酒具有的獨(dú)特的化學(xué)成分起到了一定的減輕酒精對(duì)肝臟的損傷作用[2]。

世界范圍內(nèi)有超過50%的人群感染過幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp），而Hp感染會(huì)引起一系列諸如胃黏膜炎癥、胃癌等的胃部疾病[3-4]。Hp對(duì)人胃黏膜的黏附在其定植和致病中起著關(guān)鍵作用，Hp粘附定植過程是根治Hp感染的重要靶點(diǎn)[5]。迄今為止，Hp感染的最好的治療方案依然是使用抗生素，但Hp現(xiàn)已顯示出對(duì)大部分抗生素的耐藥性，同時(shí)抗生素的使用會(huì)引起一系列的副作用[6]。

研究表明，乙醇攝入與Hp感染具有一定的關(guān)系，而醬香型白酒中除乙醇外富含醛類物質(zhì)（肉桂醛、辛醛、3-呋喃甲醛，2-噻吩甲醛等）[1]，這些醛類物質(zhì)（Aldehydes， ALDs）是否具有抑制Hp感染的作用的相關(guān)報(bào)道很少。因此，本文將醬香型白酒中的生物活性物質(zhì)及醛類化合物體外抗Hp活性及降低Hp對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞損傷活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)潛在的機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株為Sydney Strain 1（SS1）H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株，深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物系惠贈(zèng)。胃上皮GES-1細(xì)胞株（ATCC，美國(guó)），胎牛血清（FBS）（Hyclone公司，美國(guó)），青-鏈霉素（HyClone公司，美國(guó)），PBS（廣州瑞舒生物科技有限公司，中國(guó)），RPMI 1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)），NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6等試劑盒均購(gòu)于碧云天生物科技有限公司，CCK-8試劑（同仁公司，日本），Cag A和VacA抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó)），哥倫比亞瓊脂、布氏肉湯（Oxoid，英國(guó)），RPMI 1640（Hyclone，美國(guó)）。醬香型白酒（Moutai-flavour liquor，MTL）（購(gòu)于貴州茅臺(tái)集團(tuán)，貴州）。醬香型白酒中生物活性成分（Bio-active compounds in Moutai-flavour liquor， BAC）參考文獻(xiàn)方法提取獲得。醬香型白酒中醛類化合物（Aldehydes reported in Moutai flavour liquor， ALDs），標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司[7]。

1.2 儀器

三菱C-31厭氧培養(yǎng)盒（三菱，日本）;恒溫培養(yǎng)箱、超凈化工作臺(tái)（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）;超凈工作臺(tái)（SW-CJ-IC型，蘇州）;CO2培養(yǎng)箱（INCO2108型，Memmert，德國(guó)）;酶標(biāo)儀（TECAN infinite M200多功能酶標(biāo)儀，德國(guó)）;低溫高速離心機(jī)（2K15型，Sigma公司，美國(guó)）;PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad PCR儀T100，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 ALD細(xì)胞毒性檢測(cè)

GES-1細(xì)胞接種于96孔板中（5 000 cells/well），濃度為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.064、0.032及0.016 mg·mL-1的BAC、MTL、乙醇（Ethanol）及ALDs溶液加入96孔板中，培養(yǎng)24、48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

將凍存的Hp復(fù)蘇，接種于哥倫比亞瓊脂固體培養(yǎng)基，置于37 ℃微需氧環(huán)境（體積分?jǐn)?shù)為5%的O2，體積分?jǐn)?shù)為10%的CO2，體積分?jǐn)?shù)為85%的N2）中培養(yǎng)。72 h后轉(zhuǎn)至布氏肉湯液體培養(yǎng)基，置于37 ℃微需氧環(huán)境（體積分?jǐn)?shù)為0.05的O2，體積分?jǐn)?shù)為0.10的CO2，體積分?jǐn)?shù)為0.85的N2），在100 r·min-1的搖床上振蕩，擴(kuò)大培養(yǎng)。取用Hp時(shí)，將培養(yǎng)3 d的Hp菌株挑起一部分，用無菌生理鹽水洗下后，配成布氏肉湯菌懸液，再用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，校正菌液濃度，使其菌液濃度相當(dāng)于1×108 cfu·mL-1[8]。

用PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALDs至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養(yǎng)的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALDs溶液中，37 ℃振蕩搖菌60 min。將振蕩后的Hp菌液用PBS稀釋10倍，取0.10 mL涂于哥倫比亞固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)72 h，觀察Hp生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)Hp毒力基因表達(dá)的變化

用PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALD-22至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養(yǎng)的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALDs溶液中，37 ℃振蕩微氧孵育24 h，離心棄上清，用PBS沖洗3次后，使用RNA prep pure Cell/Bacteria Kit （TianGen公司，中國(guó)）分離總RNA[9]。cDNA的合成按試劑盒（SYBR@PrimeScript TM RT-PCR Kit）操作說明進(jìn)行。引物如表1所示。

1.3.4 Western blotting檢測(cè)

用PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALD-22至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養(yǎng)的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALD-22溶液中，37 ℃振蕩微氧孵育24 h，離心棄上清，用PBS沖洗3次后，按細(xì)菌蛋白提取試劑盒（Solarbio公司，中國(guó)）說明提取細(xì)菌總蛋白，Western blotting檢測(cè)細(xì)胞毒素A（Cag A）和空泡毒素A（Vac A）的蛋白表達(dá)情況[10]。

1.3.5 細(xì)胞活性及凋亡的檢測(cè)

PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、Ethanol及ALD-22至終濃度為0.064 mg·mL-1。將培養(yǎng)的Hp菌液用PBS重懸至1×107 CFU·mL-1，取0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及ALD-22溶液中，37 ℃振蕩搖菌60 min。收集細(xì)菌，PBS洗2次，調(diào)節(jié)細(xì)菌終濃度為1×108 CFU。1×105 cells/mL胃上皮GES-1細(xì)胞鋪于6孔板中培養(yǎng)24 h。不做處理設(shè)為空白對(duì)照組（Control）;加入Hp為Hp損傷組（Hp）;加入BAC處理的Hp為BAC組（BAC）;加入MTL處理的Hp為MTL組（MTL）;加入Ethanol處理的Hp為Ethanol組（Ethanol）;加入ALD-22處理的Hp為ALD-22組（ALD-22）;使Hp與GES-1細(xì)胞比例為100-1，GSE-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌：①CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞活性。②收集包括上清液漂浮細(xì)胞在內(nèi)的全部細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，用預(yù)冷的PBS洗2次，按Annexin V-FITC/PI試劑盒使用說明流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。③ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

p<0.05定為具有顯著性差異，結(jié)果均以Mean±SEM表示;對(duì)樣本先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)，用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，并進(jìn)行組間的多重比較;方差不齊時(shí)，用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，先用Kruskal-WallisHtest比較總的差異，再用Mann-Whitney U進(jìn)行兩組之間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 BAC對(duì)GES-1細(xì)胞的毒性作用

為了避免BAC及ALDs等對(duì)細(xì)胞活性造成的影響。因此，通過CCK-8方法檢測(cè)了不同濃度的BAC、MTL、Ethanol及ALDs對(duì)GES-1細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)BAC、MTL、Ethanol及ALDs濃度低于0.064 mg·mL-1時(shí)，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞活性均無顯著性差異（24，48 h，p>0.05），說明GES-1細(xì)胞未受到顯著的損傷。基于此，接下來的實(shí)驗(yàn)，BAC、MTL、Ethanol及ALDs的濃度設(shè)置為0.064 mg·mL-1。

2.2 BAC抑制Hp菌落形成

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組Hp菌落生長(zhǎng)良好，而BAC、MTL、Ethanol及ALDs處理后的Hp菌液轉(zhuǎn)移至哥倫比亞固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)后Hp菌落數(shù)目有不同程度的減少（表2）。

其中，BAC、MTL及Ethanol組Hp菌落數(shù)為21.2、26.3、28.4個(gè)，是空白對(duì)照組（35.8個(gè)）的59.2%（p<0.05），73.4%（p<0.05），79.3%（p<0.05）。說明BAC、MTL、Ethanol處理對(duì)Hp的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。此外，ALD-22（2-噻吩甲醛）對(duì)Hp生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)烈，ALD-22組Hp菌落數(shù)為20.7個(gè)菌落，是空白對(duì)照組的57.8%，Hp生長(zhǎng)受到ALD-22顯著抑制。

2.3 BAC抑制Hp對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷

Hp感染損傷胃黏膜細(xì)胞會(huì)誘發(fā)胃黏膜炎癥、胃癌等，因此，檢測(cè)了BAC處理能否降低Hp對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，與Control組相比，Hp組中細(xì)胞活力下降13.7%（#p<0.05）;而與Hp組相比，BAC、MTL、Ethanol及ALD-22實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞活力提高8.73%（p<0.05），4.22%，3.16%，7.34%（p<0.05）。推測(cè)Hp感染GES-1細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，細(xì)胞活力降低;而BAC、MTL、Ethanol及ALD-22預(yù)處理Hp會(huì)降低Hp感染GES-1細(xì)胞的能力。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，與空白對(duì)照組（7.21±0.54）%比較，Hp組GES-1細(xì)胞凋亡明顯增加（16.9±1.31）%;而相比與Hp組，BAC、MTL、Ethanol及ALD-22組細(xì)胞凋亡率為[（9.96±0.99）%、（11.4±1.17）%、（13.6±1.32）%、（7.99±0.65）%]，下降6.94%（p<0.05）、5.50%、3.30%及8.91%（p<0.05），其中BAC及ALD-22對(duì)Hp感染所致的GES-1細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用。

2.4 BAC抑制Hp感染誘發(fā)的GES-1細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌

研究報(bào)道，Hp感染會(huì)損傷胃黏膜細(xì)胞，誘發(fā)炎性細(xì)胞因子分泌[11]。因此，檢測(cè)了Hp感染對(duì)GES-1細(xì)胞中NO、ROS及IL-8、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子分泌的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，為便于比較，將Control組中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6的含量設(shè)為1。與Control組比較，Hp感染使GES-1細(xì)胞中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6分泌增加338%（p<0.05）、511%（p<0.05）、202%（p<0.05）、351%（p<0.05）及288%（p<0.05），說明Hp感染誘發(fā)GES-1細(xì)胞炎性因子分泌、氧化應(yīng)激，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷，使細(xì)胞活力降低、凋亡。而相比于Hp組，BAC組中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6分泌降低28.9%、40.1%、37.4%、18.8%及43.6%;ALD-22組中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6分泌降低23.3%、36.4%、41.6%、40.4%及41.5%;說明BAC、ALD-22預(yù)處理Hp降低了其損傷GES-1細(xì)胞的能力，使GES-1炎性因子分泌減少、氧化應(yīng)激減弱。而MTL及Ethanol中NO、ROS、IL-8、IL-1β、IL-6含量變化不明顯，推測(cè)MTL及Ethanol處理未能顯著抑制Hp感染GES-1細(xì)胞的能力。

2.5 BAC抑制Hp毒力基因及蛋白的表達(dá)

BabA是Hp外膜蛋白基因，可特異性結(jié)合宿主細(xì)胞受體，賦予Hp持久定植能力;高毒力的Hp菌株具有細(xì)胞毒素相關(guān)基因（Cag A），參與Cag A轉(zhuǎn)運(yùn)和宿主的炎癥反應(yīng)[12];空泡細(xì)胞毒素A（Vac A）能夠破壞細(xì)胞內(nèi)吞作用、抑制免疫細(xì)胞導(dǎo)致免疫耐受和慢性感染等[13]。

通過RT-PCR檢測(cè)BAC、MTL、Ethanol及ALD-22對(duì)Hp Bab A、Cag A及Vac A基因表達(dá)影響，結(jié)果如圖4所示。BAC、MTL、Ethanol及ALD-22能夠抑制Hp中外膜蛋白基因Bab A、細(xì)胞毒素基因A（Cag A）和空泡毒素基因A（Vac A）的轉(zhuǎn)錄。其中，ALD-22及BAC對(duì)Bab A、Cag A及Vac A基因表達(dá)抑制能力高于MTL及Ethanol組。相比于Hp空白對(duì)照組，ALD-22作用后，Bab A、Cag A及Vac A基因表達(dá)下降44.1%（p<0.05），68.7%（p<0.05），70.6%（p<0.05）;而BAC作用后，Bab A、Cag A及Vac A基因表達(dá)下降31%（p<0.05），71%（p<0.05），73%（p<0.05）。Bab A、Cag A及Vac A編碼的蛋白能夠誘發(fā)炎癥導(dǎo)致細(xì)胞損傷等，因此推測(cè)，BAC、ALD-22可通過抑制Hp相關(guān)基因的表達(dá)，減少Hp對(duì)GSE-1的定植及損傷。

Western Blotting進(jìn)一步分析Hp中細(xì)胞毒素A（Cag A）和空泡毒素A（Vac A）的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，BAC、ALD-22能夠顯著降低Hp中Cag A和Vac A的表達(dá)，與RT-PCR結(jié)果（圖4）類似。據(jù)推測(cè)，BAC、ALD-22可能是通過抑制Hp中相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄及毒力蛋白的表達(dá)，從而抑制Hp對(duì)胃上皮細(xì)胞的損傷。

3 討論與結(jié)論

胃上皮細(xì)胞是胃腸道黏膜機(jī)械屏障的重要組成部分，而Hp的遷移與胃腸道黏膜通透性有著密切的關(guān)系。Hp感染人體首先是通過表達(dá)Bab A等外膜蛋白黏附在胃腸道黏膜細(xì)胞上，再通過表達(dá)Vac A和Cag A等蛋白誘發(fā)炎癥和細(xì)胞損傷，進(jìn)而增加胃腸道黏膜通透性，利于其遷移。本研究表明，醬香型白酒中的生物活性物質(zhì)可抑制Hp對(duì)GSE-1細(xì)胞的黏附及因Hp感染造成的細(xì)胞活力降低及凋亡。進(jìn)一步研究表明醬香型白酒中的生物活性物質(zhì)（如醛類化合物）可能是通過抑制Hp相關(guān)毒力基因Bab A、Vac A和Cag A的轉(zhuǎn)錄，及Vac A、Cag A蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用的。此外，大量研究顯示酗酒會(huì)損傷胃腸道黏膜，醬香型白酒中的生物活性物質(zhì)雖具有抑制Hp對(duì)胃粘膜細(xì)胞損傷的活性，但仍不建議酗酒。

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