崔堂武，袁波，2，凌晨，方彬任，毛向陽，費(fèi)強(qiáng)，2

（1 西安交通大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，陜西西安710049；2 陜西省能源化工過程強(qiáng)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710049）

化石資源逐漸枯竭是現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)與城鎮(zhèn)化面臨的重要問題，因此尋找一種能夠代替化石能源的可再生清潔能源至關(guān)重要。木質(zhì)素作為自然界含量最大的可再生芳香族物質(zhì)[1]，主要來源于農(nóng)林廢棄物和造紙工業(yè)廢水[2]。但農(nóng)林廢棄物的隨意堆積焚燒和造紙工業(yè)廢水的肆意排放不僅污染環(huán)境，還導(dǎo)致木質(zhì)素資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。松柏醇（G-lignin）、香豆醇（H-lignin）和芥子醇（S-lignin）是木質(zhì)素的三種主要單體（圖1），它們通過C—C、C—O 和β-O-4等共價(jià)鍵組合連接形成無定形的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3-4]。但是由于木質(zhì)素分子量較大、沒有規(guī)則的重復(fù)單元、分子上缺乏親水和親油的官能團(tuán)等特點(diǎn)，使其具有不均勻性、無旋光性、高度分散和在水與有機(jī)溶劑中溶解度低等性質(zhì)，從而導(dǎo)致木質(zhì)素難以被有效利用[5]。木質(zhì)素的高效利用可以為生物能源和大宗化學(xué)品的獲取提供充足的原材料[6]，因此開發(fā)對(duì)木質(zhì)素合理利用的新途徑和新工藝，不僅會(huì)減少對(duì)環(huán)境的影響，而且還會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。目前在木質(zhì)素的降解方法中，物理和化學(xué)法具有反應(yīng)速率較快和反應(yīng)高效等優(yōu)點(diǎn)，但大多數(shù)反應(yīng)依賴于高溫高壓或強(qiáng)酸強(qiáng)堿，反應(yīng)條件極端，并且在一定程度上污染環(huán)境。生物法降解木質(zhì)素具有綠色、安全、專一和可持續(xù)性等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是反應(yīng)處理時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)強(qiáng)度較低。本文主要側(cè)重于生物法的相關(guān)研究。

木質(zhì)素的生物降解主要依靠微生物體內(nèi)分泌的木質(zhì)素降解酶完成，主要包括：漆酶（laccase,Lac）、 錳 過 氧 化 物 酶（manganese peroxidase,MnP）、木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase,LiP）、多功能過氧化物酶（versatile peroxidase,VP）和染料脫色過氧化物酶（dye-decolorizing peroxidase,DyP）。上述5種木質(zhì)素降解酶可通過微生物發(fā)酵獲得，主要包括發(fā)酵培養(yǎng)、離心分離、鹽析和有機(jī)溶劑分離、凝膠、離子交換和疏水層析以及最后收集步驟。何國(guó)斌等[7]采用凍干濃縮、(NH4)2SO4鹽析、Hi Trap phenyl（FF）疏水層析和Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析對(duì)靈芝EIM-40 發(fā)酵液中的Lac進(jìn)行分離純化，純化后的Lac 酶活為1511.5U/mg，純化倍數(shù)為14.6 倍，回收率為5.3%。Cai 等[8]采用(NH4)2SO4鹽析、DEAE-纖維素-32 柱和Sephadex G100層析柱對(duì)Rhizoctonia sp.SYBC-M3發(fā)酵液中的MnP 進(jìn)行分離純化，純化后的MnP 酶活為328.1U/mg，純化倍數(shù)12.6 倍，回收率為38.6%。Asgher 等[9]采用(NH4)2SO4鹽析、Sephadex G100 層析柱和DEAE-纖維素柱對(duì)Trametes versicolor IBL-04發(fā)酵液中的LiP 進(jìn)行分離純化，純化后的LiP 酶活為553U/mg，純化倍數(shù)3.3倍，回收率為3.2%。

木質(zhì)素降解酶被微生物釋放到胞外后，在催化氧化過程中形成自由基進(jìn)而攻擊木質(zhì)素。在形成許多具有高度活性的自由基中間體后，通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生了許多其他類型的自由基，導(dǎo)致木質(zhì)素分子中主要的化學(xué)鍵斷裂形成小分子化合物[10]。在降解過程中，酶活是評(píng)判微生物降解木質(zhì)素能力的重要指標(biāo)之一，但目前文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)酶活測(cè)試方法較為多樣[11]，并且受到測(cè)試底物、測(cè)試條件、非酶促反應(yīng)和其他物質(zhì)干擾等影響，這為比較分析來源不同的木質(zhì)素降解酶造成了一定的困難。為有助于生物法中酶活數(shù)據(jù)的橫向比對(duì)，本文對(duì)以上5種主要的木質(zhì)素降解酶的酶活測(cè)試方法進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)分析，對(duì)比了不同測(cè)試方法的條件，討論了每個(gè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為生物法降解木質(zhì)素的相關(guān)研究提供借鑒。

1 漆酶

1.1 漆酶的來源、特性及催化機(jī)理

圖1 木質(zhì)素主要結(jié)構(gòu)單體

漆酶（laccase，Lac）最早發(fā)現(xiàn)于漆樹的分泌物中[12]，是一種含銅的多酚氧化酶[13]。目前漆酶已在變色栓菌（Trametes versicolor）[14]和朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）[15]等真菌中發(fā)現(xiàn)。Lac 活性中心包括4個(gè)銅離子，根據(jù)其光譜學(xué)特征可分為3 類：藍(lán)型銅（Ⅰ型銅）、常型銅（Ⅱ型銅）和偶聯(lián)雙核型銅（Ⅲ型銅）[16]。銅離子所具有的氧化還原能力使Lac 能夠氧化多種類型的底物，包括酚類、芳香胺類、羧酸類以及相應(yīng)的衍生物。另外，還可氧化甾體激素、金屬有機(jī)化合物、抗壞血酸等非酚類化合物。其中，酚類底物約占底物總量的一半[17]。Lac 可以與幾類介體物質(zhì)結(jié)合共同作用于紫尿酸（violuric acid）等非酚類底物[18]，形成漆酶介體體系（laccase mediator systems，LMS），增強(qiáng)了Lac的氧化還原能力，擴(kuò)大底物范圍。

在Lac催化氧化反應(yīng)過程中，底物被氧化生成自由基或醌類物質(zhì)，氧分子被還原生成水[19]。如圖2所示，Lac催化過程可分為底物作用、電子轉(zhuǎn)移和中間體被還原等幾個(gè)步驟[20]。首先底物被Lac氧化，然后將氧化得到的電子傳遞給氧形成兩個(gè)水分子，而氧化后的自由基產(chǎn)物可能參與其他反應(yīng)形成副產(chǎn)物或者與聚合物發(fā)生降解反應(yīng)[20]。Lac具有較低的氧化還原電勢(shì)（0.5～0.8V），因此只能單獨(dú)作用于部分酚類底物，并發(fā)生Cα氧化和Cα—Cβ鍵斷裂反應(yīng)，而作用于非酚類底物時(shí)需要介體[21]。應(yīng)用LMS后，除氧化Cα和Cα—Cβ鍵外，還可進(jìn)行環(huán)裂解反應(yīng)。但是，當(dāng)2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]和1-羥基-苯并三氮唑（hydroxybenzotriazole，HBT）作為介體時(shí)有重聚合反應(yīng)發(fā)生，說明木質(zhì)素的生物降解過程是降解反應(yīng)和重聚合反應(yīng)的平衡[22]。

圖2 Lac的催化機(jī)制［20］

1.2 漆酶酶活測(cè)試方法分析

酶活測(cè)試的底物類型是決定酶活測(cè)試所應(yīng)用反應(yīng)類型的關(guān)鍵性因素，因此本文主要根據(jù)各種木質(zhì)素降解酶催化的底物類型進(jìn)行分類。表1匯總了不同Lac 酶活測(cè)試方法，其中ABTS 法應(yīng)用最廣泛。從表1 中可知，ABTS 法常用的測(cè)試波長(zhǎng)為420nm[消光系數(shù)ε420=36000L/(mol·cm)]左右。丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）作為底物時(shí)，可被氧化脫去羥基形成自由基，然后轉(zhuǎn)化為粉紅色的醌類化合物[30]， 該 方 法 的 測(cè) 試 波 長(zhǎng) 為 525nm[ε525=65000L/(mol·cm)]。雖然SGZ是測(cè)定Lac酶活最常用的底物，但是由于最終產(chǎn)物醌不溶于水，所以此方法的應(yīng)用受到限制[31]。2,6-二甲氧基苯酚（2,6-dimethoxyphenol，2,6-DMP）可以作為反應(yīng)底物，其在Lac的作用下被氧化生成3,5,3′,5′-四甲氧基二苯基醌（3,5,3′,5′-tetramethoxydiphenoquinone,DPQ）[32]。雖然鄰聯(lián)甲苯胺（3,3′-二甲基-4,4′-二氨基聯(lián)苯，3,3′-dimethylbiphenyl-4,4′-diamine）也可作為底物測(cè)定Lac酶活，但此方法的相關(guān)報(bào)道較少，此法在室溫下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)測(cè)試波長(zhǎng)為600nm[ε600=6340L/(mol·cm)]。此外，愈創(chuàng)木酚（guaiacol）和兒茶酚（鄰苯二酚，catechol）作為底物時(shí)，在Lac的作用下，可分別被氧化成醛和半醌自由基[33]，檢測(cè)波長(zhǎng)為可見光波長(zhǎng)。

表1 Lac酶活測(cè)試方法匯總

1.3 不同漆酶酶活測(cè)試方法比較

通過分析Lac 酶活測(cè)試方法可知，2,6-DMP、愈創(chuàng)木酚、SGZ、鄰聯(lián)甲苯胺和兒茶酚等方法測(cè)定醌類產(chǎn)物的吸光度隨時(shí)間變化曲線時(shí)，副反應(yīng)的存在會(huì)導(dǎo)致酶活數(shù)值偏低。而利用ABTS法的催化反應(yīng)只有一步，即從ABTS 生成ABTS+自由基產(chǎn)物，能夠更加準(zhǔn)確地反映實(shí)際酶活。此外，應(yīng)用ABTS作為底物還有其他優(yōu)點(diǎn)：①ABTS 易溶于水、性質(zhì)穩(wěn)定；②靈敏度較高；③ABTS 沒有毒性或致癌等副作用。但是，ABTS法也常受到其他因素的影響，如ABTS+可以氧化其他分子產(chǎn)生副反應(yīng)，以及ABTS+的吸光度在一定程度上受ABTS 濃度的影響等，上述因素都會(huì)導(dǎo)致酶活數(shù)值偏低。而ABTS價(jià)格昂貴、經(jīng)濟(jì)適用性不高，這也是該方法的不足之處。相比于ABTS 法，鄰聯(lián)甲苯胺屬于有毒致癌物，且水溶性較差，作為底物測(cè)得的酶活力較低；愈創(chuàng)木酚在Lac作用下生成的產(chǎn)物相對(duì)穩(wěn)定，但反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)；SGZ 的消光系數(shù)較大，有較高的靈敏度，但底物本身有刺激性，反應(yīng)濃度過高時(shí)反應(yīng)穩(wěn)定性差。綜上，ABTS 法可作為測(cè)定Lac 酶活的合適方法。

2 錳過氧化物酶

2.1 錳過氧化物酶的來源、特性及催化機(jī)理

錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）屬于一種糖基化胞外過氧化物酶，首次發(fā)現(xiàn)于白腐真菌黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）中[34]，主要以含乙烯基和酚基類化合物為底物，尤其是含丁香酚基的底物[35-36]。在H2O2和有機(jī)酸存在的條件下，MnP 與有機(jī)酸進(jìn)一步結(jié)合作用于底物，如愈創(chuàng)木酚、2,6-DMP和酚紅等。

MnP的催化循環(huán)如圖3所示，由于H2O2分子中氧原子具有強(qiáng)電負(fù)性，MnP分子中亞鐵血紅素上的雙電子首先遷移到氧氧鍵上，MnP被氧化成活性氧絡(luò)合四價(jià)鐵卟啉聯(lián)合體（MnP化合物1）[38]。然后，Mn2+失去一個(gè)電子，MnP化合物1被還原為MnP化合物2。最后，MnP 化合物2 通過單電子轉(zhuǎn)移途徑被還原成初始狀態(tài)。但當(dāng)H2O2過量時(shí)，MnP 化合物2容易被氧化失去活性[38]。

圖3 MnP的催化機(jī)理示意圖［37］

當(dāng)Mn2+被氧化成Mn3+后，由于Mn3+也可能會(huì)與MnP結(jié)合，從而失去氧化能力，所以需要加入螯合劑生成高氧化還原電勢(shì)的螯合物，進(jìn)一步氧化木質(zhì)素類底物。螯合劑的優(yōu)點(diǎn)：①促進(jìn)Mn3+與酶的分離；②使Mn3+更穩(wěn)定；③促進(jìn)游離的Mn2+與酶的結(jié)合[39]。有機(jī)酸如乳酸、酒石酸、丙二酸和草酸等是常見的螯合劑。如圖4所示，Mn3+和有機(jī)酸的螯合物能與多種底物發(fā)生單電子氧化反應(yīng)，例如酚類底物和芳香胺類底物被氧化脫氫后所生成的自由基產(chǎn)物[38]。此外，如蒽、菲和芘等芳香族有機(jī)物亦可被氧化，其中苯環(huán)可被氧化成芳香環(huán)正離子自由基[40]。脂肪酸和硫醇能被氧化脫氫生成對(duì)應(yīng)的自由基產(chǎn)物。這些自由基產(chǎn)物能和氧分子反應(yīng)生成過氧化物[38]，從而切斷木質(zhì)素中鍵能較高的化學(xué)鍵。在氧化過程中，由于木質(zhì)素分子較大，只能氧化邊緣結(jié)構(gòu)，很難滲透到分子中。但是，當(dāng)利用螯合物為介體時(shí)，分子內(nèi)部酚類結(jié)構(gòu)也可參與反應(yīng)，包括Cα—Cβ鍵斷裂、Cα氧化和芳基-烷基C—C鍵斷裂等反應(yīng)。此外在酚類介體（如藜蘆醇）和不飽和脂肪酸（如油酸或亞麻油酸）的存在下，MnP的底物范圍得到擴(kuò)展，包括氧化木質(zhì)素分子中的非酚類結(jié)構(gòu)β—O—4 鍵、C—C 鍵和β-芳基醚鍵等，從而生成香草醛和原兒茶酸等小分子物質(zhì)[21,38]。

圖4 MnP與不同底物的作用示意圖［38］

2.2 錳過氧化物酶酶活測(cè)試方法分析

在測(cè)定MnP酶活的方法中，錳離子（Mn2+）法最為常見并被普遍使用。根據(jù)測(cè)定錳過氧化物酶酶活底物的不同進(jìn)行分類，表2 匯總了不同MnP酶活測(cè)試方法。由表2 可知，當(dāng)Mn2+法反應(yīng)體系采用乳酸鈉緩沖溶液時(shí)所用波長(zhǎng)為240nm，而采用丙二酸鈉緩沖溶液時(shí)為270nm。這主要是因?yàn)楸崤cMn3+形成的螯合物在270nm 處消光系數(shù)達(dá)到最大值[ε270=11590L/(mol·cm)]，而乳酸鈉螯合物最大值在240nm 處[ε240=6500L/(mol·cm)]。Mn3+和丙二酸形成螯合物的消光系數(shù)更大，因此其他條件不變的情況下，利用丙二酸作為緩沖液時(shí)對(duì)底物濃度變化更靈敏。所以，選擇丙二酸緩沖溶液更適合Mn2+法。

表2 MnP酶活測(cè)試方法匯總

如圖5 所示，愈創(chuàng)木酚（C7H8O2）可以在MnP和Mn2+的共同作用下被氧化生成四鄰甲氧基連酚[45]。 愈 創(chuàng) 木 酚 在470nm 處 的 消 光 系 數(shù)ε470=6650L/(mol·cm)[53]，四鄰甲氧基連酚在465nm處的消光系數(shù)ε465=12100L/(mol·cm)[46]，所以在保持測(cè)定MnP活性的pH（pH=4）為最適的條件下，通過在465nm處測(cè)定產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚的吸光度變化計(jì)算得到的酶活數(shù)值更加精確。

圖5 MnP催化愈創(chuàng)木酚氧化反應(yīng)［52］

MnP可以氧化多種有機(jī)染料，包括酚紅、次甲基藍(lán)和甲基橙等[54-55]。其中酚紅[分子式C19H14O5S，消光系數(shù)ε610=22000L/(mol·cm)]與2,6-DMP 均可用于測(cè)定酶活[56]。如圖6 所示，MnP 催化氧化2,6-DMP 時(shí)，MnP 先與H2O2作用將Mn2+氧化為Mn3+而非直接作用于2,6-DMP。隨后Mn3+氧化2,6-DMP 生成醌類自由基，Mn3+被還原成Mn2+，完成一個(gè)循環(huán)。醌類中間體反應(yīng)生成二聚體，其后被Mn3+氧化生成最終產(chǎn)物醌二聚物。此二聚物最大吸收波長(zhǎng)位于469nm 處， 消光系數(shù)ε469=49600L/(mol·cm)。由上述機(jī)理可知，每生成1mol醌二聚物需要消耗4mol Mn3+。據(jù)報(bào)道，Mn3+可以和H2O2發(fā)生反應(yīng)生成H2O、O2和Mn2+，但Mn3+更傾向與酚類底物反應(yīng)，所以在此反應(yīng)過程中Mn3+和2,6-DMP 的反應(yīng)為主反應(yīng)，而與H2O2的反應(yīng)為副反應(yīng)[51]。

圖6 MnP催化氧化2，6-DMP機(jī)理［51］

2.3 不同錳過氧化物酶酶活測(cè)試方法比較

在上述方法中，除了Mn2+法是MnP 直接作用于底物外，其余方法都是MnP 間接作用于底物。采用Mn2+氧化法時(shí)，不同螯合物需在不同的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度的變化。相比于Mn3+螯合物，酚類底物更加穩(wěn)定。愈創(chuàng)木酚是一種木質(zhì)素單體模型化合物，所以在測(cè)定MnP 活性時(shí)，采取愈創(chuàng)木酚作為底物更加合適。當(dāng)用酚紅法測(cè)試MnP活性時(shí)，反應(yīng)體系中須加入明膠和NaOH，步驟較為繁瑣。此外，由于2,6-DMP 法消光系數(shù)較大，反應(yīng)較為靈敏，同時(shí)2,6-DMP 也是一種類木質(zhì)素單體化合物，對(duì)木質(zhì)素降解機(jī)理的研究有一定幫助。綜上，2,6-DMP法較適用于測(cè)定MnP酶活。

3 木質(zhì)素過氧化物酶

3.1 木質(zhì)素過氧化物酶的來源、特性及催化機(jī)理

木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase,LiP）是一種含有亞鐵血紅素的過氧化物酶，可以催化包括各類多環(huán)芳香族化合物在內(nèi)的多種底物[57]。目前已報(bào)道黃孢原毛平革 菌 （Phanerochaete chrysosporium）[58]、 采 絨 革 蓋 菌 （Coriolus versicolor）[59]、綠色糖單孢菌（Saccharomonospora viridis）[60]和樺革褶菌（Lenzites betulina）[61]等真菌均可以分泌LiP。

如圖7 所示，在催化循環(huán)過程中，LiP 為H2O2提供自由電子，自身失去兩個(gè)電子被氧化為L(zhǎng)iP Ⅰ。LiP Ⅰ再?gòu)牡孜锏玫? 個(gè)電子形成LiP Ⅱ，后者進(jìn)一步被還原為L(zhǎng)iP。在還原LiP 的同時(shí)，底物也被氧化為其他物質(zhì)[62]。LiP 具有很高的氧化還原電勢(shì)，通過形成木質(zhì)素陽離子基團(tuán)使木質(zhì)素的活性提高，達(dá)到降解酚類和非酚類木質(zhì)素化合物的目的。對(duì)于酚類底物可以發(fā)生Cα—Cβ鍵斷裂和去甲基化反應(yīng)；對(duì)于非酚類底物則可以發(fā)生芐基亞甲基的羥基化、芐基醇氧化反應(yīng)和斷裂β—O—4鍵[21,63]。

圖7 LiP的催化機(jī)理［62］

3.2 不同木質(zhì)素過氧化物酶酶活測(cè)試方法的分析及比較

根據(jù)測(cè)定木質(zhì)素過氧化物酶酶活底物的不同進(jìn)行分類，表3 匯總了測(cè)定LiP 酶活最常見的2 種方法：藜蘆醇法和天青染料B 法。藜蘆醇（veratryl alcohol,VA）分子式為C9H12O3，是常見的木質(zhì)素單體模型化合物。在LiP 的催化作用下，VA 被氧化為藜蘆醛，溶液由無色變?yōu)樘焖{(lán)色，其消光系數(shù)在310nm 處最大[ε310=9300L/(mol·cm)][67-68]。天青染料B（azure B）在LiP 的催化作用下被氧化為天青B自由基，溶液由深藍(lán)色變?yōu)闊o色，在651nm處達(dá)到最大吸光度[66,69]。由表3可知，藜蘆醇法測(cè)LiP酶活最少可在3min 內(nèi)測(cè)定，而天青B 法最少需要20min。從反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析，LiP 對(duì)藜蘆醇有較小的Km和較高的Vmax，所以所需時(shí)間較短，降低了由于酶活性降低而影響準(zhǔn)確率的可能性。然而，與310nm相比，木質(zhì)素造紙廢水、多酚和含醌樣品中的干擾物質(zhì)在651nm處的消光系數(shù)很小，因此對(duì)天青B法干擾較小。綜上所述，當(dāng)被測(cè)溶液中干擾物質(zhì)較少或?qū)z測(cè)效率要求較高時(shí)，藜蘆醇法較適合，相反當(dāng)干擾物質(zhì)多且檢測(cè)時(shí)間寬裕時(shí)可選用天青B法。

表3 LiP酶活測(cè)試方法匯總

4 多功能過氧化物酶

4.1 多功能過氧化物酶的來源、特性及催化機(jī)理

多功能過氧化物酶（versatile peroxidase, VP）在白腐真菌刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii）[70]、亞黑管 菌 （Bjerkandera fumosa）[71]和 亞 臥 孔 菌（Physisporinus vitreus）[72]中均有發(fā)現(xiàn)。VP 具有多個(gè)血紅素輔基的氧化結(jié)合位點(diǎn)及Mn2+結(jié)合位點(diǎn)，其作用底物廣泛，包括：①LiP 作用的底物，如藜蘆醇（VA）；②MnP作用的底物，如2,6-DMP和Mn2+等；③一些簡(jiǎn)單的類木質(zhì)素單體酚類化合物；④不能被LiP 和MnP 直接氧化的非酚類底物，如多環(huán)芳香烴等。

圖8 VP的催化機(jī)理［73］

4.2 不同多功能過氧化物酶酶活測(cè)試方法的分析及比較

VP 結(jié)合了LiP 和MnP 的特性，能催化多種底物包括ABTS、2,6-DMP、錳離子和酚紅等。根據(jù)測(cè)定多功能過氧化物酶酶活底物的不同進(jìn)行分類，表4匯總了不同VP酶活測(cè)試方法。由表4可知，當(dāng)采用Mn2+法測(cè)定VP 活性時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm，消光系數(shù)ε238=6500L/(mol·cm)[79]。通常ABTS法底物濃度為0.1～5mmol/L，在加入H2O2后，ABTS被催化轉(zhuǎn)化生成ABTS 自由基，在420nm 或者436nm 處測(cè)定ABTS自由基的吸光度隨時(shí)間的變化，消光系數(shù)ε420=36000L/(mol·cm)[74]和ε436=29300L/(mol·cm)[76]。酚紅法的底物濃度為0.1g/L（0.28mmol/L），檢測(cè)波長(zhǎng)610nm，消光系數(shù)ε610=22000L/(mol·cm)[78]，此法相關(guān)報(bào)道較少。在上述三種方法中，ABTS 法的消光系數(shù)最大，靈敏度較高，酚紅法次之，Mn2+法最小。此外，ABTS 法生成的產(chǎn)物更加穩(wěn)定，在一定程度上可減少測(cè)試誤差。綜上，ABTS 法可作為測(cè)定VP酶活的合適方法。

表4 VP酶活測(cè)試方法匯總

5 染料脫色過氧化物酶

5.1 染料脫色過氧化物酶的來源、特性及催化機(jī)理

染料脫色過氧化物酶（dye-decolorizing peroxidase, DyP）能氧化多種染料如蒽醌類染料、活性藍(lán)5 和活性藍(lán)19 等。過氧化物酶數(shù)據(jù)庫（peroxidase database）將血紅素過氧化物酶分為5大家族，其中DyP 屬于染料脫色過氧化物酶超家族[80]。目前，DyP 已經(jīng)于鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）[81]、 嗜 熱 單 孢 菌 （Thermobifida fusca）[82]和 熒 光 假 單 胞 菌 （Pseudomonas fluorescens）[83]等多種微生物中發(fā)現(xiàn)。如圖9 所示，在DyP 的催化氧化反應(yīng)開始前，酶（E）和H2O2存在一個(gè)平衡狀態(tài)，形成一個(gè)前體復(fù)合物E-H2O2；第二步轉(zhuǎn)化為化合物Ⅰ，并且H2O2中O—O鍵斷裂生成水，此過程不可逆。在一定的pH 范圍內(nèi)，化合物Ⅰ生成速率隨著pH 的增加而增加。隨后化合物Ⅰ與底物反應(yīng)生成化合物Ⅱ和自由基產(chǎn)物，其反應(yīng)速率與H2O2的濃度無關(guān)。最后，在化合物Ⅱ與底物反應(yīng)生成E的過程中存在一個(gè)預(yù)平衡狀態(tài)，即化合物Ⅱ-AH。整個(gè)反應(yīng)過程的限速步驟是化合物Ⅱ-AH轉(zhuǎn)化為E的過程[84]。據(jù)報(bào)道，來源于真菌的DyP比細(xì)菌DyP活性高，并能在酸性條件下催化多種底物。氧化還原介體如Mn2+和藜蘆醇等會(huì)促進(jìn)DyP的降解反應(yīng)。DyP降解木質(zhì)素過程中可發(fā)生脫羧、Cα—Cβ鍵和β—O—4鍵斷裂等反應(yīng)[85]。

圖9 DyP催化機(jī)理圖［84］

5.2 不同染料脫色過氧化物酶酶活測(cè)試方法的分析及比較

根據(jù)測(cè)定染料脫色過氧化物酶酶活底物的不同進(jìn)行分類，表5總結(jié)了不同DyP酶活測(cè)試方法。其中，ABTS 法檢測(cè)波長(zhǎng)為420nm，消光系數(shù)ε420=36000L/(mol·cm)[86]。藜蘆醇法檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm或310nm，消光系數(shù)ε310=9300L/(mol·cm)[86,88]?；钚运{(lán)5（reactive blue 5，RB5）是一種用于絲綢和錦綸纖維等材料染色的常見染料，分子式是C29H17ClN7Na3O11S3。在酶作用下，RB5 轉(zhuǎn)化為2,2′-二磺?；嫉健⑧彵蕉姿狨ズ?-[(4-氨基-6-氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]苯[91]，檢測(cè)波長(zhǎng)為600nm，消光系數(shù)ε600=800L/(mol·cm)[92]。 活 性 藍(lán)19 （reactive blue 19,RB19）具有較高的染色效率，所以被廣泛使用于棉和麻等纖維材料的染色，其分子式為C22H16N2Na2O11S3，RB19 法 在595nm 處 的 消 光 系 數(shù) 為ε595=10000L/(mol·cm)[86]。除上述三種方法可用于測(cè)定DyP 酶活外，據(jù)報(bào)道另有愈創(chuàng)木酚法、2,6-DMP法、活性藍(lán)4 法和活性紅120 法等多種方法。在上述三種方法中，ABTS 法的消光系數(shù)最大，靈敏度較高，并且生成的產(chǎn)物比較穩(wěn)定，無副反應(yīng)，測(cè)量誤差較小，測(cè)得的酶活數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確，而RB5和RB19 法存在催化效率較低和性質(zhì)不穩(wěn)定等問題。綜上，在對(duì)酶活測(cè)試精度及速度要求較高且經(jīng)濟(jì)寬裕的條件下，ABTS 法較適合于DyP 酶活的測(cè)定。

表5 DyP酶活測(cè)試方法匯總

6 結(jié)語

近年來，隨著環(huán)境、能源問題的日益突出，可持續(xù)發(fā)展已成為未來社會(huì)的發(fā)展趨勢(shì)[93]。其中，以生物質(zhì)為代表的可再生資源，是解決能源問題的重要途徑。木質(zhì)素作為生物質(zhì)的一大種類，是自然界中儲(chǔ)量豐富的可再生芳香族聚合物。近年來關(guān)于木質(zhì)素生物降解的研究成為熱點(diǎn)，包括木質(zhì)素的分離、有效表征和合理定向轉(zhuǎn)化等研究方向。生物法可以通過多種代謝途徑降解木質(zhì)素，產(chǎn)生的高附加值產(chǎn)物較為多樣，具有很高的實(shí)用價(jià)值和社會(huì)意義。目前木質(zhì)素生物降解的應(yīng)用并不多見，但在某些方面已經(jīng)體現(xiàn)出良好前景，如用于造紙工業(yè)的生物漂白、生物脫色和廢水處理，轉(zhuǎn)化生成乙醇等生物燃料和環(huán)境保護(hù)及土壤修復(fù)等方面。

在木質(zhì)素的生物降解過程中，木質(zhì)素降解酶發(fā)揮著重要的作用。酶活可以為微生物對(duì)木質(zhì)素的降解能力提供重要的參考和對(duì)比，也是木質(zhì)素降解機(jī)理研究的重要工具。但是由于酶活測(cè)試方法的多樣性，導(dǎo)致文獻(xiàn)間數(shù)據(jù)對(duì)比困難，難以對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行橫向評(píng)價(jià)與衡量。目前木質(zhì)素降解酶的酶活測(cè)試存在的主要挑戰(zhàn)有以下兩方面。

（1）酶活測(cè)試底物多樣化

測(cè)定同一種木質(zhì)素降解酶的酶活可利用其對(duì)多種底物的生物催化反應(yīng)。例如，Lac可通過催化轉(zhuǎn)化ABTS、SGZ、鄰聯(lián)甲苯胺、愈創(chuàng)木酚和兒茶酚等多個(gè)底物的反應(yīng)測(cè)定酶活，但是由于Lac對(duì)不同底物的親和力和反應(yīng)速率不同，因此造成測(cè)得的酶活數(shù)值難以橫向比較。

（2）酶活測(cè)試條件差異較大

當(dāng)選定一種底物測(cè)定酶活時(shí)，由于在測(cè)試過程中采用的條件不同也會(huì)導(dǎo)致酶活數(shù)值具有差異性。例如：緩沖溶液的pH、反應(yīng)體系的溫度和測(cè)試波長(zhǎng)等條件會(huì)對(duì)最終酶活數(shù)值有較大影響。當(dāng)采用ABTS 法測(cè)定VP 活性時(shí)，對(duì)于產(chǎn)物ABTS 自由基，測(cè)試波長(zhǎng)可采用420nm或436nm，其消光系數(shù)分別為ε420=36000L/(mol·cm)和ε436=29300L/(mol·cm)，導(dǎo)致測(cè)得的酶活數(shù)值存在差異。

本文通過比較分析為每種酶的酶活測(cè)試推薦了較適方法，若能在一定條件下使用推薦方法，則可以解決酶活測(cè)試底物多樣化和條件差異大的問題。ABTS 法因反應(yīng)靈敏、測(cè)試效率高、副反應(yīng)少且性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可作為測(cè)定Lac、VP以及DyP酶活的合適方法。若能通過優(yōu)化ABTS測(cè)試所需濃度并將ABTS溶液在低溫密封環(huán)境中保存，以及對(duì)木質(zhì)素降解酶進(jìn)行提純，則能在一定程度上避免ABTS法存在的問題。2,6-DMP法由于測(cè)試靈敏度高且屬于類木質(zhì)素單體，因此適合用于MnP 酶活測(cè)定。LiP 推薦結(jié)合使用藜蘆醇法和天青B 法，具體情況由被測(cè)溶液中干擾物質(zhì)的量以及對(duì)檢測(cè)效率的要求決定。其他方法如SGZ法、鄰聯(lián)甲苯胺法、愈創(chuàng)木酚法、兒茶酚法、Mn2+法、酚紅法和活性藍(lán)法等各具特色，可以作為木質(zhì)素降解酶的酶活測(cè)試輔助方法。綜上所述，本文通過系統(tǒng)性的分析、比較和評(píng)價(jià)主要木質(zhì)素降解酶的酶活測(cè)試反應(yīng)機(jī)理和測(cè)試方法，為木質(zhì)素降解酶研究中存在的問題提供了解決方案，為未來生物法降解木質(zhì)素的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。