季亞美 王立梅 齊 斌

(1. 蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215000；2. 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

維生素A是人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)素之一，具有促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育，維持免疫，癌癥預(yù)防以及維持視力和上皮屏障[1-3]等作用，在醫(yī)藥、食品各行業(yè)具有廣闊的市場(chǎng)。維生素A性質(zhì)非常不穩(wěn)定，容易被光、熱和氧氣分解，可以合成性質(zhì)更為穩(wěn)定的維生素A棕櫚酸酯。

脂肪酶(Triacylglycerol acylhydrolase,E.C. 3.1.1.3)是一種可以在油水界面催化三酰甘油酯水解釋放脂肪酸、甘油單酯、甘油二酯和甘油，并且催化合成各種酯類的酶[4]。脂肪酶在有機(jī)溶劑中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以在低水條件下催化酯化或者酯交換反應(yīng)，對(duì)底物具有較高的專一性和選擇性[5]，并且具有催化活性高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)迅速、固定化后可重復(fù)利用[6-9]等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多種工業(yè)生產(chǎn)及商業(yè)應(yīng)用中，被認(rèn)為是繼蛋白酶和淀粉酶之后銷量第三的酶類[10]。

賀秋紅等[11]通過篩選鑒定得到一株產(chǎn)脂肪酶的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，并對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最終脂肪酶酶活達(dá)4.3 U/mL，較優(yōu)化前提高了16.22%。賈佳等[12]以黑曲霉AspergillusnigerG27為出發(fā)菌株，通過亞硝基胍對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理，篩選得到2株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)脂肪酶菌株，與出發(fā)菌株相比，酶活分別提高了22.9%和20.1%。Pereira等[13]以芒果廢料為材料，優(yōu)化解脂耶氏酵母脂肪酶生產(chǎn)條件，其最大酶活可達(dá)3.41 U/mL。Lopes等[14]以廢棄食用油為底物，誘導(dǎo)解脂耶氏酵母W29生產(chǎn)脂肪酶，脂肪酶酶活達(dá)12 U/mL。Cui等[15]對(duì)解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的固定化載體進(jìn)行改性，并將其應(yīng)用于維生素A棕櫚酸酯的合成。

野生菌株某些特性無法滿足越來越高的工業(yè)需求，因此需要對(duì)菌株進(jìn)行誘變育種，提高菌株的性能，從而滿足生產(chǎn)需求。常壓室溫等離子體(Atmospheric room temperature plasma, ARTP)誘變是一種新興的誘變技術(shù)，與傳統(tǒng)的誘變方法如紫外誘變、化學(xué)誘變相比，ARTP可以在室溫常壓下高效誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，引發(fā)細(xì)胞SOS修復(fù)機(jī)制并得到大量高突變體樣本[16]，其操作安全、方便，因此已成為微生物誘變育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[17-18]。Liu等[19]、Yuan等[20]通過ARTP對(duì)高產(chǎn)赤蘚糖醇和高產(chǎn)丙酮酸的解脂耶氏酵母進(jìn)行了選育，但目前尚未見通過ARTP篩選高產(chǎn)脂肪酶的解脂耶氏酵母的報(bào)道。試驗(yàn)擬以一株解脂耶氏酵母菌株YL1為研究對(duì)象，通過ARTP誘變，對(duì)其進(jìn)行改造，以期篩選獲得高產(chǎn)脂肪酶且遺傳性能穩(wěn)定的目標(biāo)解脂耶氏酵母菌株，并將其應(yīng)用于維生素A棕櫚酸酯的合成，以提高維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率，為維生素A棕櫚酸酯的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酵母菌株YL1：實(shí)驗(yàn)室保藏；

酵母提取物：英國(guó)Oxoid公司；

蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、無水乙醇、橄欖油：分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；

硫酸銨：生工生物工程(上海)股份有限公司；

三丁酸甘油酯：上海源葉生物科技有限公司；

瓊脂粉：南京茂捷微生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，蔗糖5 g，橄欖油乳化液30 mL，(NH4)SO41 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min；

三丁酸甘油酯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物10 g，NaCl 10 g，三丁酸甘油酯2 mL，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱：ZQZY-CF型，上海知楚儀器有限公司；

組織搗碎勻漿機(jī)：JJ-2B型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

高效液相色譜儀：SPD-20AV型，日本Shimadzu公司；

微孔板分光光度計(jì)：XMARK型，美國(guó)Bio-Rad公司；

恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9270型，上海索普儀器有限公司；

電子天平：XS105DU型，梅特勒—托利多(上海)有限公司；

高速臺(tái)式離心機(jī)：Legend Micro 17R型，美國(guó)Thermo公司；

ARTP誘變育種儀：ⅡS型，無錫源清天木生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 挑取活化后的YL1酵母菌接種至YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min下培養(yǎng)24 h，制成種子液，其OD600 nm為0.6～0.8。種子液以體積分?jǐn)?shù)1%接入YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取1 mL菌液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清，離心后的沉淀加無菌生理鹽水懸浮，使其OD600 nm為0.6～0.8，添加甘油保護(hù)使其終濃度為5%，即為菌體懸浮液。

1.2.2 YL1菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定 種子液以體積分?jǐn)?shù)1%接種至YPD液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定600 nm處的吸光值，繪制YL1菌株生長(zhǎng)曲線并確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.3 ARTP誘變致死率曲線測(cè)定 無菌環(huán)境中取10 μL 菌體懸浮液均勻涂于無菌載片上，將載片轉(zhuǎn)移至提前滅菌處理的ARTP中，功率120 W，照射距離2 mm，工作氣體為純度99.999%的氦氣，氣量10 SML，處理時(shí)間分別為0，15，30，45，60，75，90，105，120 s。將誘變處理后的載片置于裝有1 mL無菌生理鹽水的EP管中振蕩洗脫2 min并梯度稀釋后涂布，28 ℃培養(yǎng)2 d，記錄每個(gè)梯度的菌落數(shù)。以出發(fā)菌株為參照，按式(1)計(jì)算致死率。

(1)

式中：

Z——菌株致死率，%；

X——對(duì)照組菌落數(shù)；

X1——ARTP處理后的菌落數(shù)。

1.2.4 高產(chǎn)脂肪酶解脂耶氏酵母初篩

(1) 三丁酸甘油酯平板篩選：根據(jù)致死率曲線設(shè)置合適的誘變參數(shù)進(jìn)行誘變處理，將處理后的菌懸液適度稀釋并涂布至三丁酸甘油酯培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，測(cè)定菌落水解圈直徑(H)與菌落直徑(C)，A0記為出發(fā)菌株，對(duì)突變株進(jìn)行編號(hào)，選取H/C值較大的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，備用。

(2) p-NPP法篩選：96孔板中每孔加入200 μL發(fā)酵培養(yǎng)基，將上述菌液以體積分?jǐn)?shù)3%接種至各孔中，28 ℃、150 r/min下于全溫振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵。每12 h 取樣5 μL至另一96孔板中測(cè)定發(fā)酵液酶活。除5 μL 樣品外，每孔中加入100 μL 0.05 mol/L、pH為8的Tris-HCl緩沖液和5 μL 3 mg/mL、溶劑為乙腈的p-NPP溶液，于40 ℃、150 r/min下反應(yīng)30 min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處各孔吸光度，比較突變株和出發(fā)菌株的測(cè)量值并計(jì)算相對(duì)酶活[21]，A0記為出發(fā)菌株，相對(duì)酶活為1，對(duì)突變株重新進(jìn)行編號(hào)，挑選出相對(duì)酶活較高的菌株。

1.2.5 高產(chǎn)脂肪酶解脂耶氏酵母復(fù)篩 將初篩挑選出的菌株和出發(fā)菌株分別接入YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min 下培養(yǎng)24 h，將菌液按體積分?jǐn)?shù)3%轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min下于全溫振蕩培養(yǎng)箱中搖瓶發(fā)酵，每12 h取樣1 mL，5 000 r/min離心6 min，取上清液測(cè)定脂肪酶酶活。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性分析 將突變株分別連續(xù)傳代5次，并檢測(cè)每代菌種在相同條件下發(fā)酵后的脂肪酶酶活，從而驗(yàn)證突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7 酶活測(cè)定 按GB/T 23535—2009執(zhí)行，并按式(2) 計(jì)算酶活力[22]。

(2)

式中：

X——樣品酶活力，U/mL；

V1——滴定樣品時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V2——滴定空白時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

c——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；

50——每1 mL 0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于50 μmol 脂肪酸；

n1——樣品稀釋倍數(shù)，取值為1；

0.05——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；

1.2.8 維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化 向25 mL具塞錐形瓶中加入0.164 g維生素A醋酸酯、0.32 g棕櫚酸、0.48 g冷凍干燥后的酶粉和10 mL正己烷，30 ℃、200 r/min下振蕩反應(yīng)24 h，取反應(yīng)液1 mL ，吸取20 μL進(jìn)樣，高效液相色譜分析檢測(cè)。色譜柱為InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為100%甲醇，檢測(cè)器為SPD-20AV，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，流速1 mL/min，按外標(biāo)法[23-24]計(jì)算。以反應(yīng)體系內(nèi)酯化生成維生素A棕櫚酸酯的量計(jì)算轉(zhuǎn)化率，并按式(3)進(jìn)行計(jì)算。

(3)

式中：

Z——轉(zhuǎn)化率，%；

C——生成的維生素A棕櫚酸酯的摩爾數(shù)，mol；

C1——起始的底物維生素A醋酸酯的摩爾數(shù)mol。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.0、SPSS 20.0及GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 YL1酵母菌生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，將菌液以體積分?jǐn)?shù)1%接入YPD液體培養(yǎng)基中，接種14 h內(nèi)菌體濃度幾乎沒有變化，屬于菌株生長(zhǎng)延滯期；14～38 h內(nèi)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體適應(yīng)環(huán)境后迅速繁殖，生長(zhǎng)代謝旺盛；38 h后菌株進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)菌株處于對(duì)數(shù)期時(shí)，菌體繁殖迅速，代謝活性很高，易發(fā)生突變且重復(fù)性好[25]。因此，選擇接種26 h時(shí)的菌株進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)。

圖1 YL1酵母菌生長(zhǎng)曲線

2.2 最佳誘變時(shí)間的確定

由圖2可知，隨著誘變處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株致死率明顯升高。當(dāng)誘變處理時(shí)間為45 s時(shí)，致死率為25.04%；當(dāng)誘變處理時(shí)間為60 s時(shí)，致死率為97.45%；當(dāng)誘變處理時(shí)間為105 s時(shí)，致死率為98.5%；當(dāng)誘變處理時(shí)間為120 s時(shí)，致死率接近100%。Lu等[26-29]認(rèn)為，致死率較高時(shí)更易發(fā)生突變且正突變率較高。為了提高篩選效率以及獲得足夠進(jìn)行篩選的樣本，選擇誘變處理時(shí)間為60 s，其致死率為97.45%。

2.3 高產(chǎn)脂肪酶菌株初篩

2.3.1 三丁酸甘油酯平板篩選 菌株產(chǎn)生的脂肪酶會(huì)分解三丁酸甘油酯，形成水解圈，水解圈越大說明菌株產(chǎn)脂肪酶能力越強(qiáng)。三丁酸甘油酯平板見圖3，其篩選結(jié)果見表1。

由表1可知，出發(fā)菌株A0的H/C值為6.0，從83株突變株中挑選H/C值>6.0的58株突變株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2 p-NPP法篩選H/C值>6.0的58株突變株接入96孔板發(fā)酵60 h后的相對(duì)酶活如圖4所示。由圖4可知，大部分菌株發(fā)生正向突變，其中有8株正突變菌株的脂肪酶相對(duì)酶活比出發(fā)菌株的提高了40%～90%，編號(hào)分別為A6、A10、B3、C2、C4、D7、D8和E4，從中挑選A6、A10、C4和E4 4株菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 誘變處理時(shí)間對(duì)菌株YL1致死率的影響

圖3 三丁酸甘油酯平板圖

2.4 高產(chǎn)脂肪酶菌株復(fù)篩

將4株突變株接種至搖瓶發(fā)酵，24 h后每12 h取樣測(cè)定酶活，其結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，與出發(fā)菌株A0相比，4株突變株的酶活均有一定提高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)酶活最高。發(fā)酵培養(yǎng)60 h后，出發(fā)菌株A0酶活為7.34 U/mL ，突變株A6酶活為12.22 U/mL，比出發(fā)菌株酶活提高了66.5%；突變株A10酶活為11.21 U/mL，

表1 三丁酸甘油酯平板篩選結(jié)果

圖4 出發(fā)菌株及突變株的相對(duì)酶活

比出發(fā)菌株酶活提高了52.7%；突變株C4酶活為13.76 U/mL，比出發(fā)菌株酶活提高了87.5%；突變株E4酶活為9.49 U/mL，比出發(fā)菌株酶活提高了29.3%。因此，確定突變株C4為目標(biāo)菌株。96孔板篩選顯示酶活提高的菌株在搖瓶發(fā)酵中也表現(xiàn)了高酶活，說明96孔板快速篩選突變株脂肪酶的方法是可行的。但是由于96孔板發(fā)酵體系的縮小，可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過程中含氧量、營(yíng)養(yǎng)成分的變化，限制酶產(chǎn)量，使最終結(jié)果不夠精準(zhǔn)。因此，96孔板篩選可以初步大批量初篩，提高篩選效率，縮小范圍后搖瓶復(fù)篩得到最優(yōu)菌株。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

由圖6可知，第1代菌株產(chǎn)脂肪酶酶活最高為13.84 U/mL，雖然每代菌株的產(chǎn)脂肪酶能力存在微小差距，但酶活基本維持在13.40 U/mL左右，差異不顯著(P>0.05)。因此，突變株C4的遺傳性能穩(wěn)定，與任春梅等[30]的重組菌株P(guān).pastorisX-33/pPICZαA-CALB相比，突變株C4的發(fā)酵時(shí)間縮短至60 h，且酶活更高。

2.6 維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率

出發(fā)菌株A0和突變株C4發(fā)酵后制得粗酶粉，正己烷體系內(nèi)轉(zhuǎn)化24 h后的樣液HPLC結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，出發(fā)菌株A0和突變株C4反應(yīng)液中維生素A棕櫚酸酯的保留時(shí)間分別為35.034，35.064 min，與標(biāo)品的保留時(shí)間(35.271 min)基本一致，故確定產(chǎn)物為維生素A棕櫚酸酯。通過計(jì)算，突變株C4較出發(fā)菌株A0催化合成維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率提高了36.9%。

圖5 出發(fā)菌株及突變株搖瓶復(fù)篩的酶活

圖6 突變株C4脂肪酶活力的測(cè)定及其遺傳穩(wěn)定性分析

圖7 高效液相色譜圖

3 結(jié)論

以解脂耶氏酵母菌株YL1為研究對(duì)象，利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行處理，研究誘變時(shí)間對(duì)菌株致死率的影響，確定處理菌株的最佳時(shí)間為60 s，此時(shí)致死率為97.45%。采用三丁酸甘油酯平板試驗(yàn)和p-NPP法結(jié)合初步篩選突變菌株，經(jīng)搖瓶復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)確定目標(biāo)菌株C4，其脂肪酶酶活為13.4 U/mL，較出發(fā)菌株A0提高了82.6%。該菌株所產(chǎn)脂肪酶可以應(yīng)用于維生素A棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化，與出發(fā)菌株相比，突變株C4的轉(zhuǎn)化率提高了36.9%。但該研究?jī)H將誘變菌株C4所產(chǎn)脂肪酶在維生素A棕櫚酸酯轉(zhuǎn)化中與出發(fā)菌株進(jìn)行了對(duì)比，后續(xù)試驗(yàn)有待進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基以提高脂肪酶酶活。