肖蘇婷 姚政 周琳 楊培慧

摘?要?紅細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附作用研究對(duì)揭示心血管疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。在病理狀態(tài)下， 紅細(xì)胞的氧化損傷會(huì)使胞膜糖蛋白受體中的唾液酸含量下調(diào)以及細(xì)胞粘彈性質(zhì)的改變，導(dǎo)致紅細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性增強(qiáng)?；谕僖核崤c3-氨基苯硼酸具有特異性識(shí)別作用，本研究采用耗散型石英晶體微天平（QCM-D）建立了一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氧化損傷紅細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間粘附的新方法。以H2O2氧化損傷紅細(xì)胞為研究模型，通過(guò)QCM傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)紅細(xì)胞粘附過(guò)程頻率和耗散因子的變化， 評(píng)價(jià)其氧化損傷程度。結(jié)果表明，隨著H2O2濃度增加，QCM頻率和耗散因子變化值均隨之減小，表明紅細(xì)胞的粘附與H2O2濃度和紅細(xì)胞的氧化損傷程度呈負(fù)相關(guān)。為了模擬血管內(nèi)環(huán)境，將血管內(nèi)皮細(xì)胞固定于芯片界面，采用QCM實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其與紅細(xì)胞的粘附，結(jié)果表明，隨著紅細(xì)胞損傷程度增加，細(xì)胞間的黏附逐漸增強(qiáng)。 本研究建立了一種簡(jiǎn)便、免標(biāo)記、高靈敏、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞間粘附并評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化損傷的新方法，拓展了QCM技術(shù)在生物體系細(xì)胞功能研究中的應(yīng)用范圍。

關(guān)鍵詞?紅細(xì)胞; 氧化損傷; 內(nèi)皮細(xì)胞; 黏附; 石英晶體微天平

1?引 言

紅細(xì)胞（Red blood cells， RBCs）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的損傷與黏附是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的初始因素。RBCs膜表面含有胞膜糖蛋白C3b 受體，其主要成分為唾液酸，也是RBCs負(fù)電荷的主要來(lái)源，能夠阻止RBCs聚集。在生理?xiàng)l件下，正常RBCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不發(fā)生黏附; 在病理?xiàng)l件下，如受到氧化損傷時(shí)RBCs膜的唾液酸表達(dá)量會(huì)下調(diào)，并發(fā)生細(xì)胞形態(tài)改變和變形能力下降，導(dǎo)致RBCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附增強(qiáng)[1]。研究表明，多種疾病的發(fā)生機(jī)制與RBCs和內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附性增強(qiáng)有關(guān)[2]。因此，發(fā)展簡(jiǎn)便、靈敏、免標(biāo)記的分析方法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RBCs與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，對(duì)深入了解心血管疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance， QCM）是一種具有納克級(jí)靈敏度的新型質(zhì)量傳感分析技術(shù)，通過(guò)監(jiān)測(cè)石英晶體的共振頻率變化（Δf）可反映晶體表面吸附物質(zhì)的質(zhì)量變化，具有高靈敏、免標(biāo)記、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[3，4]。耗散型石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance with dissipation， QCM-D）可通過(guò)監(jiān)測(cè)耗散因子（ΔD）的變化反映晶體表面吸附物質(zhì)的粘彈性變化，進(jìn)而反映細(xì)胞的形變和硬度。近年來(lái)，在細(xì)胞黏彈性、細(xì)胞粘附和細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)等方面的研究備受關(guān)注 [5～7]。Muramatsu等[8]利用QCM結(jié)合顯微鏡技術(shù)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的響應(yīng)和粘附過(guò)程。Cui等[9]利用QCM-D技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腦蛋白/肝素復(fù)合膜上的黏附和擴(kuò)散，顯示了細(xì)胞在含有不同成分薄膜中具有不同的粘附機(jī)理。Noiri等[10]通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)構(gòu)建聚乙二醇/磷脂復(fù)合膜并修飾RGD多肽用于粘附人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，表明細(xì)胞粘附行為受液體流動(dòng)式樣的影響。Yang等[11]構(gòu)建了聚乙烯亞胺/透明質(zhì)酸復(fù)合膜界面用于特異性識(shí)別乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)的CD44分子，以QCM傳感器評(píng)估具有不同遷移能力的MDAMB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞的粘附行為。Zhu等[12]以QCM傳感器監(jiān)測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在金芯片上的粘附、擴(kuò)散和增殖，并以H2O2氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致其在金芯片上的擴(kuò)散和覆蓋面積下降，且此過(guò)程與H2O2濃度呈正相關(guān)。Shoaib等[13]以QCM-D傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)H2O2氧化損傷MC3T3小鼠成骨細(xì)胞的粘彈性，顯示了氧化損傷對(duì)細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)的影響。本研究組利用QCM傳感器結(jié)合質(zhì)量型納米粒子信號(hào)放大技術(shù)定量檢測(cè)了RBCs膜表面的唾液酸[14]，并通過(guò)氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用QCM傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了RBCs與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用[15]。由于在病理?xiàng)l件（如氧化應(yīng)激、高血糖等）的刺激下會(huì)引起RBCs損傷和胞膜糖蛋白C3b 受體中唾液酸表達(dá)量下調(diào)，導(dǎo)致RBCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附增強(qiáng)，因此，發(fā)展QCM傳感器表征氧化損傷RBCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附作用，將有助于理解心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，并同時(shí)為細(xì)胞功能研究提供新思路。

因此，本研究以H2O2氧化損傷RBCs為研究模型，基于氧化損傷RBCs引起的膜表面唾液酸表達(dá)量下調(diào)和細(xì)胞粘彈性改變導(dǎo)致RBCs與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附增強(qiáng)， 采用QCM-D傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氧化損傷RBCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附（如圖1所示）。利用3-氨基苯硼酸（3-Aminophenylboronic acid， APBA）特異性識(shí)別RBCs膜表面的唾液酸，以APBA功能化的金芯片捕獲RBCs，通過(guò)頻率變化監(jiān)測(cè)不同損傷程度RBCs的黏附; 以聚賴(lài)氨酸（Polylysine， PLL）非特異性界面通過(guò)粘附內(nèi)皮細(xì)胞模擬血管內(nèi)環(huán)境，通入損傷RBCs，連續(xù)追蹤細(xì)胞間的粘附，為表征細(xì)胞間的粘附以及細(xì)胞功能研究提供了新方法。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

KSV Z-500石英晶體微天平（KSV Instrument公司）; CHI660a電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）; Zetasizer Nano Zeta電位儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）; 5 MHz AT切型金芯片（晶體直徑14 mm，電極直徑10 mm，深圳市仁路科技有限公司）。

APBA、 PLL、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride， EDC）、 N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethyl formamide， DMF）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，巰基丁二酸（Mercaptosuccinic acid， MSA）、維生素C（Vitamin C， Vc）均購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司，以上試劑均為分析純; 30% H2O2（上海阿拉丁試劑公司）; 槲皮素（Quercetin， Que， 純度97%，上海源葉生物科技有限公司）; 胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖溶液 （Phosphate buffer saline， PBS）均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司; 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2?內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和RBCs的處理

HUVECs來(lái)源于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，接種于含有10%胎牛血清和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3天進(jìn)行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化內(nèi)皮細(xì)胞，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs用于QCM實(shí)驗(yàn)。

正常人全血來(lái)源于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，按照文獻(xiàn)[13]的方法從正常人全血中分離出RBCs，接著用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L H2O2分別處理RBCs 2 h，再用PBS清洗并離心得到不同氧化損傷程度的RBCs懸液。Que保護(hù)RBCs的處理方法是在1.0 mL PBS中加入RBCs懸液0.1 mL，再加入50 μmol/L Que處理10 min，接著加入0.6 mmol/L H2O2溶液調(diào)節(jié)至總體積為2.0 mL，作用2 h。維生素C處理RBCs的方法與Que相同。

2.3?QCM-D的測(cè)量

金芯片的預(yù)處理： 用超純水超聲清洗15 min，再用Piranha溶液（30% H2O2-H2SO4， 1∶3， V/V）清洗5 min，然后交替用30%乙醇和蒸餾水各清洗3次，最后用N2吹干，備用。在干凈的金芯片表面滴涂5 mmol/L MSA，室溫過(guò)夜后，用乙醇和水依次交替清洗2～3次。將修飾的MSA金芯片用2.0 μg/mL PLL孵育2 h，用超純水清洗除去過(guò)量的PLL，得到MSA/PLL功能化金芯片; 用100 mmol/L EDC的DMF溶液處理15 min，活化金芯片表面的羧基，加入20 mmol/L APBA孵育1 h，然后用蒸餾水沖洗金芯片上過(guò)量的APBA，得到APBA功能化金芯片。

將功能化金芯片安裝于QCM流通池中，設(shè)置流速為200 μL/min，調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度控制保持25℃，通入PBS緩沖溶液待基線穩(wěn)定，通入1 ×105 cells/mL RBCs或內(nèi)皮細(xì)胞，記錄諧波次數(shù)n=3時(shí)Δf和ΔD隨時(shí)間變化的曲線。

2.4?電化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

采用上海辰華公司CHI660a電化學(xué)工作站，以QCM流通池作為電化學(xué)池，電解質(zhì)溶液為10 mmol/L [K3Fe（CN）6]3/4+ 0.1 mol/L KCl溶液，采用三電極體系：金芯片工作電極、鉑對(duì)電極和Ag/AgCl參比電極，掃描速率100 mV/s，電壓范圍0.2～0.6V，記錄循環(huán)伏安曲線。

3?結(jié)果與討論

3.1?APBA修飾傳感界面的表征

基于APBA對(duì)唾液酸的特異性識(shí)別，構(gòu)建了APBA功能化金芯片界面粘附RBCs，并用QCM和循環(huán)伏安法進(jìn)行表征。由圖2A可知，隨著RBCs通入流通池QCM頻率變化（|Δf|）明顯增大，由于生理狀態(tài)RBCs表面表達(dá)有唾液酸，其與芯片界面APBA特異性識(shí)別發(fā)生粘附作用，從而引起頻率明顯下降，表明RBCs粘附于傳感器界面。如圖2B所示，Au/MSA/APBA/RBC的層層修飾阻礙了金芯片的電子傳遞，導(dǎo)致氧化還原峰電流下降，進(jìn)一步表明了RBCs在傳感器界面上的粘附。將損傷RBCs和正常RBCs分別通入流通池，其頻率隨時(shí)間的變化曲線如圖2C所示，損傷RBCs因膜表面的唾液酸含量下調(diào)，導(dǎo)致粘附性能下降，其頻率變化低于正常細(xì)胞。上述結(jié)果表明，構(gòu)建的QCM傳感器能有效地監(jiān)測(cè)損傷RBCs與正常RBCs在芯片界面粘附行為的差異。

3.2?QCM傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氧化損傷RBCs的黏附

以不同濃度H2O2處理RBCs，采用QCM傳感器于監(jiān)測(cè)不同氧化損傷程度的RBCs黏附。由圖3A可見(jiàn)，頻率變化值|Δf|隨著H2O2濃度增大而降低，由于受H2O2氧化損傷，RBCs唾液酸表達(dá)量下降，RBCs在傳感界面粘附減少，|Δf|值回升，表明RBCs的粘附與H2O2濃度和RBCs氧化損傷程度呈負(fù)相關(guān); 圖3B為不同濃度H2O2處理RBCs的Zeta電位圖，Zeta電位隨H2O2濃度升高而降低，說(shuō)明氧化損傷的RBCs所帶負(fù)電荷減少，是由于RBCs膜表面帶負(fù)電荷的唾液酸表達(dá)量下調(diào)，這與文獻(xiàn)[16]的結(jié)果相符。因此，QCM傳感器可對(duì)不同氧化損傷程度的RBCs產(chǎn)生靈敏的信號(hào)響應(yīng)。此外，所構(gòu)建的APBA功能化傳感界面粘附RBCs具有良好的穩(wěn)定性，通?？芍貜?fù)使用3次，QCM頻率測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%。

3.3?QCM-D傳感器監(jiān)測(cè)氧化損傷RBCs的粘彈性

氧化損傷RBCs會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，在此可用聚賴(lài)氨酸非特異性界面QCM-D傳感器監(jiān)測(cè)不同損傷程度RBCs的耗散因子ΔD隨頻率的變化，并以細(xì)胞粘彈性指數(shù)|ΔD/Δf|表征細(xì)胞粘彈性，其值越大，細(xì)胞粘彈性越大，細(xì)胞形變能力也越大。由圖4A和圖4B可知，|ΔD/Δf|值隨著處理濃度的增加而下降，說(shuō)明RBCs的粘彈性降低，細(xì)胞形變能力下降。由文獻(xiàn)[16]可知，RBCs氧化損傷會(huì)導(dǎo)致形變能力下降。進(jìn)一步將50 μmol/L抗氧化劑AA和Que應(yīng)用于降低RBCs的氧化損傷，如圖4C所示，相對(duì)于單獨(dú)0.6 mmol/L H2O2處理組，抗氧化劑保護(hù)組的粘彈性指數(shù)更接近對(duì)照組，而且與對(duì)照組相比，抗氧化劑組不存在顯著性差異（p>0.05），表明抗氧化劑對(duì)RBCs具有保護(hù)作用。

3.4?QCM傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)損傷RBCs與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附

以聚賴(lài)氨酸非特異性界面粘附血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬血管內(nèi)環(huán)境，在流通池中通入損傷RBCs，利用QCM傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RBCs與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附。QCM行為曲線如圖5A所示，其中的Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)分別表示QCM頻率響應(yīng)的PBS基線區(qū)、內(nèi)皮細(xì)胞粘附界面區(qū)和RBCs粘附區(qū)，從Ⅲ區(qū)的曲線可知，損傷RBCs的頻率變化明顯大于正常RBCs，說(shuō)明在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，氧化損傷RBCs比正常細(xì)胞具有更強(qiáng)的黏附能力，這與文獻(xiàn)[17]報(bào)道正常RBCs的粘附能力較弱相符。此外，第Ⅲ區(qū)域的頻率變化隨著處理RBCs的H2O2濃度的增加而增大，如圖5B所示，隨著RBCs氧化損傷程度的增加，RBCs與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附作用增強(qiáng)。

4?結(jié) 論

基于QCM發(fā)展了一種免標(biāo)記、高靈敏、連續(xù)監(jiān)測(cè)氧化損傷RBCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附過(guò)程的新策略。通過(guò)構(gòu)建特異性識(shí)別唾液酸的APBA功能化傳感界面和模擬血管內(nèi)環(huán)境的血管內(nèi)皮細(xì)胞傳感界面，成功監(jiān)測(cè)到RBCs的黏附和細(xì)胞粘彈性均與H2O2濃度呈負(fù)相關(guān)，并連續(xù)追蹤了損傷RBCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附行為，進(jìn)而可評(píng)估RBCs的氧化損傷程度。本研究為表征細(xì)胞間的粘附以及細(xì)胞功能研究提供了新方法。

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