劉夢旋 尹建行 孟磊 徐娜

摘?要?甲硝唑（MNZ）是普遍使用的一種硝基咪唑類抗生素，多用于治療厭氧菌引起的感染或動物飼料的添加劑，殘留過量時會產生致畸、致癌等作用，因此準確檢測MNZ十分必要。本研究利用微波技術，采用一步法成功合成了聚乙烯亞胺保護的銀納米簇（AgNCs@PEI）熒光探針，所合成的AgNCs在高離子強度及長時間光照下具有良好的熒光穩(wěn)定性。AgNCs配體中的大量氨基官能團與MNZ中咪唑環(huán)內N原子之間的氫鍵作用，使二者形成穩(wěn)定的非輻射基態(tài)配合物，導致AgNCs熒光強度下降，基于此建立了檢測MNZ的熒光分析方法。線性范圍為0.1～200 μmol/L，檢出限為0.038 μmol/L（S/N=3），方法具有良好的選擇性。將此熒光探針應用于人尿液中MNZ的測定，回收率為95.8%～103.4%，相對標準偏差小于4.3%。

關鍵詞?聚乙烯亞胺; 銀納米簇; 甲硝唑; 熒光探針

1?引 言

甲硝唑（MNZ）是硝基咪唑類抗生素中的一種，主要用于臨床治療和預防厭氧菌引起的感染疾病 [1～3]; 同時還具有促進牛、豬及家禽生長和提高飼料喂養(yǎng)效率的作用，也是一種常用的動物飼料添加劑。當MNZ的累積劑量或殘留量超過一定數值時，則具有潛在的致畸、致癌、致突變作用和遺傳毒性 [4～6]。 因此開發(fā)高選擇性、高靈敏檢測MNZ的方法十分必要。

目前，檢測MNZ主要方法有高效液相色譜法[7，8]、高效液相色譜-質譜法[9]、 電化學分析法[10，11]和氣相色譜法[12，13]等，但這些方法大多存在靈敏度低、過程繁瑣、成本高等缺點。相比于傳統(tǒng)的檢測方法，基于熒光探針的分析方法具有靈敏度高、快速、廉價、簡單以及實用性強等特點。銀納米簇（AgNCs）作為一種新型的熒光納米材料，因其具有量子產率高、發(fā)射波長可調、生物相容性好等優(yōu)點，被廣泛用于生物成像、分析檢測、催化等領域[14～16]。合成AgNCs的傳統(tǒng)方法有水熱法[17]、化學刻蝕法[18]等，但這些方法仍存在AgNCs粒徑均勻性較差、穩(wěn)定性不佳、制備過程復雜等問題。微波合成法利用其介電熱效應將電磁能轉化為熱能，與傳統(tǒng)合成方法相比，該方法所制備的納米材料具有尺寸均一、物理化學性質穩(wěn)定、制備過程易于控制且合成時間較短等特點[19，20]。

本研究采用一步微波法合成了一種基于聚乙烯亞胺保護的銀納米簇（AgNCs@PEI），合成方法簡單、快速、成本低。制備的AgNCs@PEI穩(wěn)定性良好，可作為熒光探針對痕量MNZ進行檢測，方法靈敏度高、選擇性好。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

T20型透射電子顯微鏡 （美國FEI公司）; ?LS-55熒光分光光度計（英國PE公司）; ?UV-2200雙單色器雙光束紫外可見分光光度計 （北京瑞利分析儀器公司）; FE20型pH計 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）; ?MAS-II Plus常壓微波合成/萃取反應工作站（上海新儀微波化學科技有限公司）;

聚乙烯亞胺（PEI，MW 10000）、 MNZ、谷胱甘肽（GSH）（上海阿拉丁試劑公司）; ?AgNO3（國藥集團化學試劑有限公司）; 抗壞血酸（AA）、牛血清蛋白（BSA）以及20種天然氨基酸（Val、Met、Cys、Ile、Pro、Arg、Phe、Gly、Gln、Glu、Thr、Trp、Ser、Ala、Asp、Lys、Leu、Asn、Tyr、His）（南京奧多福尼生物科技有限公司）。所用試劑均為分析純; 實驗用水為超純水。

所用緩沖溶液為Briton-Robinson（BR）緩沖溶液，由一定比例的0.04 mol/L的磷酸、硼酸、醋酸混合而成，用NaOH溶液調節(jié)pH值分別為3～11。

2.2?實驗方法

2.2.1?AgNCs@PEI的合成?參考文獻[21]的方法并稍作改進。將3.75 μmol/L PEI溶于15 mL超純水，加入3.75 μmol/L AgNO3，攪拌2 h后，用1.0 mol/L的HCl或NaOH調節(jié)混合體系的pH值為3～11; 最后加入AA，將混合溶液置于微波合成儀中，在60℃、100 W條件下反應一段時間，所得反應液用0. 22 μm 濾膜過濾，于4℃保存，備用。

2.2.2?MNZ的檢測?800 μL不同濃度的MNZ 溶液分別與200 μL AgNCs@PEI、1000 μL BR緩沖液（pH 6）混合，靜置 2 min，測定反應體系的熒光光譜，激發(fā)波長455 nm。

2.2.3?選擇性測試?配制 10 mmol/L Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl、CO23、HCO3、HPO24、H2PO4、PO34、葡萄糖與20種天然氨基酸（Val，Met，Cys，Ile，Pro，Arg，Phe，Gly，Gln，Glu，Thr，Trp，Ser，Ala，Asp，Lys，Leu，Asn，Tyr，His）溶液。取800 μL不同物質溶液和200 μL AgNCs@PEI、1000 μL BR緩沖液（pH 6）混合，靜置2 min，測定熒光光譜，激發(fā)波長455 nm。

2.2.4?實際樣品分析?尿液來源于健康志愿者。在200 μL尿液中添加800 μL不同濃度的MNZ，與200 μL AgNCs@PEI原液、800 μL BR緩沖液（pH 6）混合，靜置孵育2 min，測定熒光光譜，激發(fā)波長455 nm。

3?結果與討論

3.1?AgNCs@PEI的表征

圖1A為AgNCs@PEI的透射電鏡圖，可以看出納米顆粒的分散性高且粒徑均一，平均粒徑約為2.6 nm，其晶面間距為0.236 nm（圖1B），為Ag（111）晶面[22]，表明成功合成了AgNCs@PEI。在AgNCs@PEI的吸收光譜中，在350 nm附近存在一個較寬的吸收峰（圖1C），但沒有表面等離子體共振（SPR）吸收帶，表明不存在大的Ag納米顆粒。圖1D為AgNCs@PEI的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜，最大激發(fā)波長為455 nm，最大發(fā)射波長為545 nm，說明AgNCs@PEI具有較大的斯托克斯位移（～90 nm）。如圖1E所示，AgNCs@PEI的XPS譜圖中Ag的特征峰表明，AgNCs主要由Ag0和Ag+組成，簇表面Ag+的存在，有利于電子由PEI向AgNCs轉移，從而產生熒光[23]。

3.2?AgNCs@PEI合成條件優(yōu)化

3.2.1?合成反應時間對熒光強度的影響?保持其它實驗條件不變，在不同合成反應時間下制備AgNCs@PEI，測定其熒光光譜。實驗結果表明，反應時間為15 min時，所制備的AgNCs@PEI熒光強度最高（圖2A）。相比于文獻[21]中采用的溶液攪拌方法（～48 h）， 合成時間大幅縮短，說明微波方法可以有效提高合成效率。

3.2.2?pH值對熒光強度的影響

用1 mol/L的HCl或NaOH分別將PEI和AgNO3混合溶液的pH值調至3、5、7、9和11，然后向其中加入37.5 μmol/L AA，在微波合成儀中反應15 min，得到不同的AgNCs@PEI。由圖2B可知，合成溶液的pH =5時，得到的AgNCs@PEI的熒光強度最高。

3.2.3?Ag+與AA的摩爾比對熒光強度的影響?保持其它實驗條件不變，在Ag+與AA的摩爾比分別為1∶1、1∶5、1∶10和1∶15時，采用微波合成儀合成不同的 AgNCs@PEI。結果顯示（圖2C），當Ag+與AA的摩爾比為1∶10時（3.75 μmol/L AgNO3，37.5 μmol/L AA），AgNCs@PEI的熒光強度最高。此結果與文獻[21]一致。

3.3?AgNCs@PEI的穩(wěn)定性

在高離子強度下， 考察了AgNCs@PEI的穩(wěn)定性和抗光漂白性能。圖3A為AgNCs@PEI在 545 nm處熒光強度隨NaCl濃度變化的柱狀圖，可見AgNCs@PEI熒光強度隨NaCl濃度的變化較小，說明AgNCs@PEI在高濃度離子溶液中具有較好的熒光穩(wěn)定性。由圖3B可知，AgNCs@PEI經455 nm （光強度 750 a.u.）光照30 min后， 其熒光強度基本保持穩(wěn)定，表明合成的AgNCs@PEI具有良好的光穩(wěn)定性。在不同pH值下，AgNCs@PEI在545 nm的熒光強度如圖3C所示，在酸性和中性條件下的熒光強度較高。

3.4?AgNCs@PEI對MNZ的檢測

3.4.1?可行性測試及檢測條件的優(yōu)化?在制備的AgNCs@PEI中分別加入200和500 μmol/L MNZ，熒光光譜如圖4A所示。結果表明，MNZ能夠淬滅AgNCs@PEI的熒光，且隨著MNZ濃度增加，AgNCs@PEI熒光猝滅程度增大。圖4B為AgNCs@PEI對MNZ（500 μmol/L）的熒光響應時間，可見熒光強度隨時間的延長而下降，在1 min后趨于穩(wěn)定。為了得到穩(wěn)定的熒光響應信號，后續(xù)實驗均在孵育 2 min后進行測試。此外，考察了檢測體系的pH值對熒光響應的影響，分析了不同pH值下MNZ對AgNCs@PEI熒光的猝滅效果。如圖4C所示，在體系中加入500 μmol/L MNZ，AgNCs@PEI的熒光強度在pH=6時熒光猝滅程度最高，因此選擇檢測MNZ體系的pH=6。

3.4.2?AgNCs@PEI對MNZ的分析性能?不同濃度MNZ存在時， AgNCs@PEI的熒光光譜圖如圖5A所示。隨著MNZ濃度增加，AgNCs@PEI在545 nm處的熒光強度隨之下降，在1500 μmol/L時基本完全猝滅。在545 nm處的相對熒光強度（F0-F，F0和F分別表示加入MNZ前后的探針熒光強度）與MNZ濃度在兩段濃度范圍內均呈良好的線性關系（圖5B）。在15～200 μmol/L范圍內，線性方程為F0-F=1.2644CMNZ +66.5298（R2=0.9946）; 在 0.1～15 μmol/L范圍內，線性方程為F0-F=4.3308CMNZ+13.7640（R2=0.9916），檢出限（S/N=3）為0.038 μmol/L。與文獻報道的檢測MNZ的納米熒光探針相比，本方法的檢出限及線性范圍與其它方法相當或者更優(yōu)（表1）。

3.4.3?AgNCs@PEI對MNZ熒光響應的選擇性分析?考察了AgNCs@PEI對不同離子及氨基酸的抗干擾性能。在分別含有500 mmol/L MNZ和其它分析物的檢測體系中，只有MNZ能夠明顯猝滅AgNCs@PEI的熒光，而其它分析物對AgNCs@PEI熒光響應變化值<6.5%（圖6），說明基于AgNCs@PEI探針檢測MNZ具有良好的選擇性。

3.4.4?檢測機理研究?具有較大斯托克斯位移的熒光納米簇，其熒光的產生主要來源于以金屬為中心的三線激發(fā)態(tài)輻射弛豫，而非金屬簇內核量子化束縛所引起的[29]。這種弛豫過程與納米簇的保護配體有關，例如配體分子內的振動和轉動常導致三線激發(fā)態(tài)非輻射弛豫的發(fā)生。因此，研究加入MNZ前后AgNCs@PEI配體的微觀變化，有助于探究其熒光猝滅的機理。AgNCs@PEI和MNZ混合物的紫外-可見吸收光譜如圖7A所示，MNZ加入AgNCs@PEI 后， 在323 nm處出現一個新的吸收峰（曲線c），且此特征峰較MNZ的特征峰（318 nm， 曲線a）發(fā)生相對紅移。AgNCs@PEI吸收光譜的改變可能是由于MNZ咪唑環(huán)內N原子（具有非共用電子對）易與PEI中大量氨基官能團產生較強的氫鍵作用，形成穩(wěn)定的配合物。此配合物使PEI分子內的振動及轉動加劇，導致三線激發(fā)態(tài)電子發(fā)生非輻射復合及熒光猝滅。此外，由于MNZ中含有吸電子能力很強的硝基官能團，也可能導致激發(fā)態(tài)電子發(fā)生電荷轉移而出現熒光猝滅。對AgNCs@PEI加入MNZ前后的熒光壽命進行分析的結果如圖7B所示，壽命擬合數據見表2，加入MNZ前后的熒光壽命基本未發(fā)生變化，說明MNZ并未影響AgNCs@PEI的光電子輻射弛豫過程[30]。

3.5?實際樣品分析

采用本方法檢測人尿樣中的MNZ。尿樣中未檢出MNZ。在尿樣中分別添加10.0、50.0和100.0 μmol/L MNZ標準樣品，采用本方法進行測定，加標回收率在95.8%～103.4%之間，相對標準偏差 （RSDs） 均低于4.3%（表3），表明AgNCs@PEI具有良好的應用潛能。

4?結 論

合成了基于聚乙烯亞胺保護的銀金屬納米簇熒光探針（AgNCs@PEI），能夠在高離子強度環(huán)境中且長時間光照下穩(wěn)定存在，合成方法簡便、快速、成本低。AgNCs@PEI配體中的大量氨基官能團與MNZ咪唑環(huán)內N原子（具有非共用電子對）可產生較強的氫鍵作用，形成穩(wěn)定的非輻射配合物，導致AgNCs@PEI熒光的猝滅，基于此建立了MNZ的熒光檢測方法。本方法具有檢出限低、靈敏度高、重現性好的特點， 并用于尿液中MNZ的檢測。本方法有望拓展到疾病診斷、水質分析等領域。

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