嚴 晨，蔣雪松*, 沈 飛, 何學明，方 勇，劉 琴，周宏平, 劉興泉

1. 南京林業(yè)大學機械電子工程學院，江蘇 南京 210037 2. 南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023 3. 浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院, 浙江 杭州 311300

引 言

花生作為一種重要的油料作物，在世界各地均有大規(guī)模種植。 在生長和儲藏過程中，花生易受溫度、濕度的影響而發(fā)生霉變。 感染的有害霉菌會產(chǎn)生一種毒性很強的次生代謝產(chǎn)物——黃曲霉毒素[1]。 黃曲霉毒素是一種高毒性和致癌性的化合物，會嚴重影響花生的品質(zhì)和安全。 其中以黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)毒性最大，對動物和人體有較高的健康威脅，被國際癌癥研究機構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[2]。 依照《GB2761 2017食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》, 我國對花生及其制品中黃曲霉毒素B1限量指標為20 μg·kg-1 [3]。

傳統(tǒng)的黃曲霉毒素檢測方法如薄層色譜法，高效液相色譜法以及酶聯(lián)免疫吸附法等[4]雖然精確，但操作較復雜、成本較高且不適合實時控制，不能滿足花生儲運及交易時快速檢測要求。 因此需要一種快速、便捷且有效檢出花生中黃曲霉毒素B1超標的方法。 由于近紅外光譜技術以及機器視覺技術的無損、快速等特性，國內(nèi)外已有學者將該技術應用于糧食安全的檢測中[5-8]。 從大多研究結(jié)果來看，近紅外光譜技術和圖像技術有能力對霉菌侵染程度準確判別和預測； 但是大多研究以不同濃度毒素浸泡的樣品作為研究對象，且以靜態(tài)檢測為主，動態(tài)檢測自然霉變花生中黃曲霉毒素B1的報道較為罕見。

本研究以自然霉變的花生籽粒為對象，動態(tài)獲取其可見-近紅外光譜和圖像信息，結(jié)合化學計量法建立花生中黃曲霉毒素B1超標與否的檢測方法，實現(xiàn)AFB1超標花生的動態(tài)篩選，為最終實現(xiàn)花生質(zhì)量安全的在線監(jiān)測提供技術參考。

1 實驗部分

1.1 材料

花生籽粒通過市場選購，品種為大白沙，產(chǎn)地山東青島，挑選表面沒有破損、發(fā)霉及發(fā)芽且大小相似的花生籽粒。

1.2 方法

利用分析天平稱取150份，每份100 g的花生，將150份花生樣品放置在帶有透氣孔的方形容器中。 轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中，在28 ℃，85%相對濕度(RH)的條件下儲藏8 d。 以樣品放入人工氣候箱時刻作為第0天，選取儲藏節(jié)點0, 4, 6, 7和8 d取樣，每次相同時刻取出30份用于分析，將第0 d花生樣品作為對照組，并將樣品放置于密封袋中于-4 ℃冰柜冷藏，待后續(xù)分析。

1.3 花生樣品可見-近紅外光譜和機器視覺動態(tài)采集

圖1為可見-近紅外光譜與機器視覺動態(tài)檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)由可見-近紅外光譜儀(德國Zeiss公司MCS 600型)、OMK500-H/NIR漫反射探頭(德國Zeiss公司)、MV-

圖1 可見-近紅外光譜和機器視覺檢測系統(tǒng)

1： 驅(qū)動電機； 2： 鍵鼠； 3： 載物盤； 4： 漫反射探頭； 5： 顯示器； 6： 光纖； 7： 光譜儀； 8： 暗箱； 9： 數(shù)字相機； 10： 環(huán)形光源； 11： 傳送帶

Fig.1 Visible/near infrared spectroscopy and

machinevisioninspectionsystem

1： Drive motor； 2： Keyboard； 3： Slide plate； 4： Diffuse reflection probe； 5： displayer； 6： Optical fiber； 7： Spectrograph； 8： Camera obscura； 9： Digital camera； 10： Ring light source； 11： Conveyor

EM120C/M型相機(陜西維視圖像公司)、LED環(huán)形光源、暗箱、驅(qū)動電機、傳送帶、電腦顯示器、光纖以及載物盤等部分構(gòu)成。

采集前將冷藏(-4 ℃)的花生樣品置于室溫下(23±1) ℃下2 h以上，直至樣品平衡到室溫。 為使光譜系統(tǒng)穩(wěn)定，將紅外光譜儀預熱30 min。 首先對光譜進行黑白校正，之后將花生樣品放置于直徑90 mm高15 mm的石英培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置于載物盤上，樣品上表面距探頭約20 mm，樣品表面光斑約3.14 cm2。 樣品隨傳送帶以0.15 m·s-1速度運動至漫反射探頭下方時，采集樣品光譜(560～1 700 nm)，積分時間設置為100 ms； 當樣品隨傳送帶以0.15 m·s-1速度運動至數(shù)字相機正下方時，采集樣品圖像，此時樣品上表面距數(shù)字相機鏡頭約310 mm，圖片分辨率為1 280×960像素，以JPEG格式存儲； 每個樣品重復裝樣并采集光譜和圖像各三次，取平均分析。

顯然，只有當掃描到待充電設備的兩端建立連接，發(fā)射端讀取接收端反饋并寫入當前待充電設備的型號、電量等信息后開始充電且充電判斷完成，才為一次一對一的無線充電成功。

1.4 樣品AFB1含量

參照GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中酶聯(lián)免疫吸附篩查法，在工程師的指導下，利用黃曲霉毒素B1ELISA試劑盒(北京華安麥科生物技術有限公司)測量樣品AFB1含量。

樣品前處理： 粉碎并取5.0 g有代表性的花生樣本置入100 mL具塞三角瓶中，加入40%甲醇25 mL與其混合； 于振蕩器上劇烈振蕩10 min，轉(zhuǎn)速為200 r·min-1； 取液體于4 000 r·min-1離心5 min； 取上清液1 mL，加入40%甲醇2 mL，振蕩10 s； 取液體1 mL，再加入4 mL去離子水； 振蕩5 s，取50 μL進行分析。

操作步驟： 加入標準品或樣本50 μL到對應的微孔中，加入AFB1酶標物50 μL·孔-1，再加入AFB1抗試劑50 μL·孔-1，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25 ℃避光環(huán)境中反應30 min； 小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液300 μL·孔-1； 充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干； 加入底物液A液50 μL·孔-1，再加底物液B液50 μL·孔-1，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25 ℃避光環(huán)境反應15 min。 加入終止液50 μL·孔-1，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于雙波長450/630 nm處，測定每孔OD值。

利用試劑盒配套的專業(yè)分析軟件計算每個樣本的AFB1含量。 結(jié)果顯示，隨儲藏時間的增加，4 d已有5份樣品AFB1超標，6 d及之后的大部分花生樣品AFB1含量開始逐漸超過20 μg·kg-1，超標率為58%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用MATLAB 2015b軟件(美國Matheorks公司)和Unscrambler X10.4軟件(Camo Analytics公司)對花生樣品的光譜和圖像信息進行處理和建模。 為消除基線漂移、噪聲等帶來的誤差，采用多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)，Savitzky-Golay(S-G)平滑和標準正態(tài)變量校正(standaedized normal variate，SNV)等方法對光譜進行預處理，并基于主成分分析(principal component analysis，PCA)權重系數(shù)優(yōu)選特征波長作為后續(xù)模型輸入。 利用灰度化、形態(tài)學運算等方法對圖像信息進行處理，剔除無效信息，以圖像的RGB(紅色、綠色、藍色)和HIS(色調(diào)、飽和度、亮度)的各分量均值以及方差作為圖像特征參數(shù)。 將獲取的光譜特征波長和圖像特征參數(shù)融合作為樣品的總特征信息。 在建立模型前，先運用主成分分析提取主要數(shù)據(jù)并進行聚類分析； 再通過線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)與支持向量機(support vector machine，SVM)建立花生黃曲霉毒素B1侵染程度的判別模型。 模型建立時，將150份樣品按2∶1隨機分為建模集和預測集。 按照國家標準，將高于20 μg·kg-1的樣本作為超標樣本，低于20 μg·kg-1的樣本作為未超標樣本。 在模型中將未超標樣本記為類N，超標樣本記為類Y。

2 結(jié)果與討論

2.1 可見-近紅外光譜分析

利用可見-近紅外系統(tǒng)動態(tài)采集花生樣品光譜，選取光譜范圍600～1 600 nm進行分析。 圖2為五份不同黃曲霉毒素B1含量的樣品原始光譜和二階導數(shù)光譜圖。 原始吸收光譜圖(圖2a)與其他研究報道的相符，不同AFB1含量的樣品光譜整體相似，在962，1 150以及1 415 nm三個波長附近有吸收峰。 有相關研究表明，這分別與蛋白質(zhì)中N—H的二級振動、淀粉或脂質(zhì)中C—H的二級振動、水中O—H的一級基頻振動等有關[9]。 為了進一步分析，對光譜進行二階導數(shù)處理以消除大量噪音并放大部分波段。 圖2(b)觀察到在920，1 080，1 180和1 320 nm等波峰附近，隨著霉變程度的加深，AFB1侵染水平的增加，吸光度在逐漸降低，這種現(xiàn)象在一些小麥和玉米的真菌感染研究中也有所描述[10]。 真菌污染過程中，花生中的成分發(fā)生改變，如脂肪作為主要碳源被消耗，并被分解為游離脂肪酸和甘油脂，而脂肪對于1 180 nm處的近紅外光吸收較為敏感[11]。 此外，在近紅外波長范圍內(nèi)，光譜差異總體上是由散射現(xiàn)象決定的，可能真菌污染會破壞花生籽粒的細胞壁并使籽粒變得多孔，從而增加近紅外波長范圍內(nèi)的散射光，導致吸光度有所降低[12]。

圖2 五種不同AFB1含量的花生樣品原始(a)與二階導數(shù)(b)光譜圖

2.2 花生圖像信息分析

利用MATLAB 2015b對花生樣品圖像進行處理。 首先對圖像灰度化處理，將彩色圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像，以減少計算量，加快處理速度。 再將灰度圖像二值化處理，利用最大類間方差法將圖像分割為目標和背景兩部分。 最后提取圖像的RGB和HIS顏色模型中的各顏色分量均值和方差作為圖像顏色特征參數(shù)。 從圖3和圖4中觀察發(fā)現(xiàn)，隨著毒素含量的增加，花生樣品RGB值總體呈下降趨勢，表面顏色變化較為明顯，低于20 μg·kg-1的花生樣品表面干凈有光澤，20～50 μg·kg-1樣品顏色則相對暗淡，已有少量菌絲附著。 當毒素含量超過100 μg·kg-1時，花生樣品表面暗淡并且有大量菌絲覆蓋，霉變嚴重。

圖3 不同AFB1含量的花生樣品原始圖像和對應灰度圖

圖4 不同AFB1含量的花生樣品RGB值變化圖Fig.4 RGB value of peanut samples contaminatedwith different levels of AFB1

2.3 主成分分析

為適應動態(tài)檢測的需要，需提取特征波長作為模型輸入以提高模型運算速度。 PCA權重系數(shù)α可用來選取特征波長，權重系數(shù)曲線中的局部最高峰和最低峰都可認為是一個特征波長[13]。 在圖5中，PC1的加載曲線較為平滑，最佳波長不明顯，而PC2和PC3有較為明顯的峰值，選擇630，1 067，1 150，1 227，1 390和1 415 nm作為最佳波長。

圖5 花生樣品的前3主成分權重系數(shù)圖Fig.5 Weighting coefficients for PC1—PC3 of peanut samples

利用PCA根據(jù)毒素水平可以探尋樣品分組的可能性。 圖6是花生樣品的光譜、圖像和數(shù)據(jù)融合信息的PCA得分圖，前兩個主成分貢獻之和在71%～99%之間，體現(xiàn)了原始數(shù)據(jù)中的大多數(shù)變化。 從圖6(a)和(b)中可以觀察出雖然有小部分樣品重疊，但是整體上仍存在一定的聚類趨勢。 這表明，隨著霉變程度的加深，毒素含量的變化，花生的可見-近紅外光譜也隨之發(fā)生一定的改變，為后續(xù)定性判別提供了基礎。 而圖6(c)和6(d)中觀察到第一第二聚類趨勢不明顯，大部分樣品重疊，無法實現(xiàn)超標樣品和未超標樣品的區(qū)分。 這可能由于毒素的含量較低以及非產(chǎn)毒菌落的影響，因此需要進一步建立判別分析模型來識別超標和未超標樣本。

2.4 花生樣品AFB1超標與否的定性判別分析

PCA雖然可探尋出不同樣品之間的聚類趨勢，但是并不能表達出具體的分類結(jié)果。 因此采用LDA和SVM判別分析方法分別基于全譜段、最佳波長、圖像和數(shù)據(jù)融合建立花生AFB1超標與否的定性分析模型。

圖6 花生樣品第一、第二主成分得分圖(a)： 可見-近紅外全譜段； (b)： 特征波長； (c)： 圖像； (d)： 特征波長與圖像融合特征參數(shù)Fig.6 Score plot of PC1 and PC2 of peanut samples(a)： Visible/near-infrared full-band； (b)： Characteristic wavelength； (c)： Image； (d)： Spectral and image fusion characteristic parameters

通過對光譜數(shù)據(jù)使用不同預處理方法開發(fā)了多種LDA判別模型； 通過對全譜段光譜平滑去噪以及消除散射處理，經(jīng)S-G和MSC處理的全譜段光譜分類準確性相對原始光譜略有提升，預測集提升至92%，而原始光譜的特征波長模型分類準確性優(yōu)于經(jīng)處理的光譜。 表1和表2分別是根據(jù)樣品全譜段、特征波長、圖像以及特征波長和圖像融合信息建立的LDA和SVM模型結(jié)果。 可以看出全譜段下，SVM模型效果低于LDA模型，最佳建模集準確率分別為89%和94%，最佳預測集準確率分別為82%和92%； Tao[14]等利用可見-近紅外光譜對侵染6個AFB1濃度梯度的花生進行鑒別研究，以20 μg·kg-1作為分類閾值，基于全譜段建立的PLS-DA和LS-SVM模型準確率分別達到88.6%和90%，與本研究結(jié)果類似。

表1 基于不同數(shù)據(jù)形式的花生樣品LDA分類模型結(jié)果Table 1 Results of LDA classification model of peanut samples based on different data forms

表2 基于不同數(shù)據(jù)形式的花生樣品SVM分類模型結(jié)果Table 2 Results of SVM classification model of peanut samples based on different data forms

為了滿足在線應用的需要，探討了基于特征波長建立的LDA和SVM模型。 從表1和表2觀察到以特征波長作為輸入的LDA和SVM模型效果相對全譜段有所降低，最優(yōu)模型為88%，這可能是由于提取特征波長時將一些相關信息遺失，但在一定程度上提高了運算速度，降低了模型的復雜程度。 隨著儲藏時間的延長，有害霉菌逐漸繁殖并排放毒素，導致花生樣品的外觀特征產(chǎn)生變化，如花生圖像顏色逐漸灰暗，亮度降低，籽粒多孔等，使得圖像特征參數(shù)產(chǎn)生一定的變化。 為了進一步提高模型的準確性，引入花生樣品圖像顏色特征參數(shù)建立判別模型。 不同核函數(shù)的SVM模型分類準確率不同，以徑向基函數(shù)核(RBF kernel)為核函數(shù)的Nu-SVM模型效果最優(yōu)，預測集準確率為90%。 LDA在利用光譜信息建立判別模型中表現(xiàn)相對較優(yōu)，而非線性模型SVM則更適合于基于圖像信息建模。

黃曲霉毒素B1的侵染會引起花生內(nèi)部品質(zhì)如蛋白質(zhì)和脂肪的變化，這些變化能引起近紅外光譜的改變，從而能夠間接指示花生中毒素的含量。 將來自圖像的外觀特征和近紅外光譜的內(nèi)部化學鍵信息進行融合處理，綜合兩者的優(yōu)勢，能在一定程度上提升分類模型的效果。 在此基礎上分別建立LDA和SVM融合模型。 表1觀察到LDA融合模型相對于單獨應用特征波長和圖像信息時的分類準確度均有所提升，其中以Baseline-LDA融合模型效果提升最大，預測集分類準確度提高12%。 表2的6種SVM融合模型中，除Sigmoid內(nèi)核的SVM融合模型效果略微下降，其余模型均有不同程度提升。 縱觀所有融合模型，以RBF為核函數(shù)的C-SVM融合模型效果最優(yōu)，分類準確度達到92%，相較于利用特征波長建模效果提升18%。 結(jié)果表明，可見-近紅外光譜技術和機器視覺技術獲得花生樣品的內(nèi)部和表面信息并結(jié)合化學計量法，能夠?qū)崿F(xiàn)花生樣品黃曲霉毒素B1的動態(tài)判別，且表現(xiàn)出可觀的精度。

3 結(jié) 論

以自然霉變花生為研究對象，對可見-近紅外光譜結(jié)合機器視覺技術動態(tài)分類黃曲霉毒素B1超標和未超標花生的可能性進行了探索。 結(jié)果表明不同AFB1侵染程度的花生光譜和圖像呈現(xiàn)一定的差異； 進一步采用LDA和SVM建立的花生黃曲霉毒素B1超標判別模型擁有良好的準確性，并且通過優(yōu)選特征波長建模能夠簡化模型，提高運行速度，有利于動態(tài)應用。 利用近紅外信息結(jié)合表面圖像信息建立LDA和SVM判別模型，相較單獨利用特征波長建立模型準確率有所提高，模型最佳識別率提升至92%。 因此利用可見-近紅外光譜結(jié)合機器視覺技術，實現(xiàn)花生AFB1含量超標與否的動態(tài)判別具有一定可行性。