梁昊岳，程雪蓮，楊晚竹，溫 偉，董樹旭，趙軾軒，茹永新

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)，實驗血液學(xué)國家重點實驗室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300020

引 言

急性白血病是指原始的造血細(xì)胞，尤其是白細(xì)胞以克隆、不受控制和自主的方式遭受惡性轉(zhuǎn)化，并伴隨它們的功能、形態(tài)和成熟順序上的改變而引起的一種惡性腫瘤。 常按形態(tài)分為髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病兩大類。 白血病的診斷基于一系列測試，從血細(xì)胞計數(shù)篩查開始，能夠評估血細(xì)胞，然后進(jìn)行更具侵入性的脊髓造影檢查，分析相關(guān)的血管內(nèi)細(xì)胞[1-2]。 這些形態(tài)學(xué)化驗不足以進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，因此，臨床醫(yī)生要求進(jìn)行更復(fù)雜的實驗室檢查，例如流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，以便進(jìn)行確鑿的診斷[3-4]。 然而，這些檢查方法對細(xì)胞樣本具有侵入性且耗時較長，因此，探索一種新型白血病細(xì)胞鑒別方法具有重要的科研和臨床意義。

拉曼光譜是一種新型光學(xué)技術(shù)，能夠識別與病理狀況相關(guān)的生物組織和液體的生化變化，診斷血清中的阿爾茨海默癥以及體外定量人體血液和血清成分等。 拉曼效應(yīng)是基于可極化分子對入射激光的非彈性散射，有著提供不同材料的振動能級的詳細(xì)信息的強(qiáng)大能力。 Vanna等通過拉曼光譜技術(shù)鑒定正常和白血病細(xì)胞[5]，Ehlicke等鑒別了間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的不同光譜特征[6]。 Hobro等應(yīng)用拉曼光譜來提供有關(guān)不同淋巴細(xì)胞的細(xì)胞系組成的生化信息。 雖然拉曼光譜法測量的淋巴細(xì)胞系之間的生化差異很小，但結(jié)合偏最小二乘判別分析，不僅可以區(qū)分T細(xì)胞和B細(xì)胞，而且可以區(qū)分單個T細(xì)胞和B細(xì)胞系[7-8]。

當(dāng)被應(yīng)用于血液及腫瘤疾病的診斷時，拉曼光譜技術(shù)具有諸如體內(nèi)使用的可能性、快速性，不需要試劑或染料來揭示組織生化信息，以及使用少量樣品非破壞性地獲得診斷等優(yōu)勢[9]。 本實驗使用拉曼光譜技術(shù)對人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系(Jurkat)、人急性骨髓性白血病細(xì)胞系(KG-1α)、人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系(NB4)和人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(THP-1)展開研討，獲取拉曼光譜數(shù)據(jù)，通過光譜分析軟件建立區(qū)分四種細(xì)胞系的方法。 同時，探討拉曼光譜特征，以期為四種急性白血病細(xì)胞的早期鑒別診斷提供一種新方式。

1 實驗部分

1.1 四種急性白血病細(xì)胞系的培養(yǎng)和傳代

細(xì)胞系Jurkat、NB4用RPMI 1640 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，在37 ℃飽和濕孵箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞系KG-1α用Iscove’s Modified Dulbecco’s培養(yǎng)液(含20%胎牛血清)，在37 ℃孵箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞系THP-1用含10%胎牛血清和終濃度0.05 mmol·L-12-mercaptoethanol的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃飽和濕孵箱中培養(yǎng)。

1.2 拉曼光譜檢測

將培養(yǎng)的細(xì)胞系細(xì)胞借助甩片機(jī)Cytospin4涂于石英玻片上，做成待測樣本。 實驗選用共聚焦拉曼光譜儀XploRA Raman microscope對目的細(xì)胞展開檢測。 選取785 nm激光作為激發(fā)光，輸出功率為40 mW，物鏡選取40倍，拉曼光譜記錄波數(shù)范圍為600～1 800 cm-1，標(biāo)本固定在XYZ三維平臺上，在鏡下隨機(jī)選取一個白血病細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行拍攝，拍攝過程使用×40 0.75 NA尼康鏡頭，樣品上約2×2 μm的光斑大小范圍接收輸出功率為40 mW的激光束照射，每種急性白血病細(xì)胞系捕獲25～30個細(xì)胞光譜數(shù)據(jù)，每個細(xì)胞掃描累積時間為250 s，分辨率為1 cm-1。 應(yīng)用Labspec6軟件進(jìn)行平滑、去背景和基線校正等數(shù)據(jù)處理，全部光譜以各自的1 450 cm-1拉曼峰為內(nèi)標(biāo)完成了強(qiáng)度歸一化。

1.3 拉曼光譜數(shù)據(jù)分析及診斷模型建立

采用SIMCA-P應(yīng)用軟件對四種白血病細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行主成分分析、偏最小二乘判別分析和聚類分析，建立四種急性白血病細(xì)胞鑒別模型。 所有數(shù)據(jù)操作使用Origin軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種急性白血病細(xì)胞平均拉曼光譜的外形比較

本研究共獲得急性白血病細(xì)胞系細(xì)胞拉曼特征光譜113例，其中jurkat細(xì)胞29例，THP-1細(xì)胞29例，kG-1α細(xì)胞30例，NB4細(xì)胞25例(圖1)。 細(xì)胞光譜的拉曼峰位歸屬見表1。 在600～1 800 cm-1的范圍內(nèi)可見四種白血病細(xì)胞拉曼光譜，形態(tài)相似，可以充分地反映出不同種白血病細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的含量、組分。

圖1 四組細(xì)胞平均拉曼光譜Fig.1 The mean spectrum of the four groups with Raman peaks

表1 細(xì)胞拉曼光譜的峰位歸屬Table 1 Molecular structure and composition of Raman peaks

續(xù)表1

2.2 四種急性白血病細(xì)胞的主成分分析、偏最小二乘判別分析及聚類分析比較

從4類細(xì)胞拉曼光譜結(jié)果中隨機(jī)抽取40張?zhí)卣鞴庾V(每類10張)，構(gòu)成四組數(shù)據(jù)資料。 對樣本數(shù)據(jù)分析應(yīng)用有監(jiān)督主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)展開詳細(xì)分析比照。 圖2表明運用有監(jiān)督的PCA和PLS-DA方法可以很好地甄別jurkat，THP-1，kG-1α和NB4細(xì)胞的光譜數(shù)據(jù)。 PLS-DA模型質(zhì)量參數(shù)R2X=0.434，R2Y=0.863，Q2=0.693，模型質(zhì)量參數(shù)表示該模型歸納了第一、第二兩種主成分整體信息的43.4%，概括了因變量86.3%的變異信息，預(yù)估精確度為69.3%。 PCA模型質(zhì)量參數(shù)R2X=0.589，Q2=0.274。 PLS-DA比PCA更好地捕捉了光譜中的差異信息，樣本之間的區(qū)分度更好，分群效果更加顯著。 圖3所示四種細(xì)胞使用PCA和PLS-DA得到的得分、載荷和聚類結(jié)果比較情況，可知PLS-DA對四種白血病細(xì)胞系具有更好的鑒別效果。 四種細(xì)胞主要通過769，826，844，957，1 048，1 141，1 255，1 313，1 415，1 539和1 575 cm-1等峰位進(jìn)行區(qū)分[圖3(d)]。

圖2 四組細(xì)胞PCA和PLS-DA分析二維及三維得分散點圖對比結(jié)果(a): PCA二維散點圖； (b): PLS-DA二維散點圖； (c): PCA三維散點圖； (d): PLS-DA三維散點圖Fig.2 Two-dimentional and three-dimentional score scatter figurecomparison of PCA and PLS-DA result of the four groups(a): PCA two-dimentional score scatter figure； (b): PLS-DA two-dimentional score scatter figure； (c): PCA three-dimentional score scatter figure； (d): PLS-DA three-dimentional score scatter figure

圖3 四組細(xì)胞PCA和PLS-DA分析對比結(jié)果(a): PCA柱狀圖； (b): PLS-DA柱狀圖； (c): PCA載荷折線圖； (d): PLS-DA載荷折線圖； (e): PCA載荷柱狀圖； (f): PLS-DA載荷柱狀圖； (g): PCA聚類分析圖； (h): PLS-DA聚類分析圖Fig.3 Comparison of PCA and PLS-DA result of the four groups(a): PCA column figure； (b): PLS-DA column figure； (c): PCA loading line figure； (d): PLS-DA loading line figure； (e): PCA loading column figure； (f): PLS-DA loading column figure； (g): PCA cluster figure； (h): PLS-DA cluster figure

2.3 四種急性白血病細(xì)胞兩兩組合主成分分析結(jié)果

為進(jìn)一步驗證四種細(xì)胞的譜峰差別，比較兩種分析模型的差異，將四種細(xì)胞兩兩組合進(jìn)行有監(jiān)督PCA并分析擬合參數(shù)情況。 如圖4、圖5所示，四種細(xì)胞被兩兩成功區(qū)分，PCA擬合參數(shù)如表2所示。 PCA模型的R2X參數(shù)值處于0.43～0.581區(qū)間范圍內(nèi)，表示模型對光譜數(shù)據(jù)信息具備一定概括能力； 但Q2參數(shù)值處于0.093 6～0.163區(qū)間范圍內(nèi)，表示模型可預(yù)估精確程度低，模型的總體效果不甚理想。

2.4 四種急性白血病細(xì)胞兩兩組合偏最小二乘判別分析結(jié)果

按前文所述方法將四種細(xì)胞兩兩組合進(jìn)行PLS-DA并分析擬合參數(shù)情況。 如圖6、圖7所示，四種細(xì)胞被兩兩成功區(qū)分，PLS-DA擬合參數(shù)如表3所示。 模型R2Y處于0.91～0.996區(qū)間范圍內(nèi)，Q2參數(shù)值處于0.706～0.94區(qū)間范圍內(nèi)，表明該模型能描述因變量的變異信息和模型可預(yù)估精確程度很理想，基本滿足四種白血病細(xì)胞兩兩區(qū)分的辨別要求。 Jurkat vs THP-1和 KG-1α vs NB4兩個組合中模型R2X參數(shù)值較低，可能是由于這兩組中兩類細(xì)胞的光譜相似性較高，需要更多的主成分來表征它們的信息內(nèi)容，因此模型概括第一、第二主成分的信息比重較少。

圖4 四組細(xì)胞兩兩組合PCA二維得分圖Fig.4 Two-dimentional score figure for PCA model from two combinations of the four groups

圖5 四組細(xì)胞兩兩組合PCA三維得分圖Fig.5 Three-dimentional score figure for PCA model from two combinations of the four groups

圖6 四組細(xì)胞兩兩組合PLS-DA二維圖Fig.6 Two-dimentional score figure for PLS-DA model from two combinations of the four groups

圖7 四組細(xì)胞兩兩組合PLS-DA三維圖Fig.7 Three-dimentional score figure for PLS-DA model from two combinations of the four groups

表2 四組細(xì)胞兩兩組合PCA模型質(zhì)量參數(shù)Table 2 Model quality parameter for PCA model fromtwo combinations of the four groups

表3 四組細(xì)胞兩兩組合PLS-DA模型質(zhì)量參數(shù)Table 3 Model quality parameter for PLS-DA modelfrom two combinations of the four groups

通過載荷分析，jurkat細(xì)胞在708，957和1 243 cm-1峰高于KG-1α細(xì)胞，在789和920 cm-1峰低于KG-1α細(xì)胞[圖8(a)]。 jurkat細(xì)胞在826，842，957，971，1 155，1 243，1 313，1 547和1 596 cm-1峰高于NB4細(xì)胞，在920 cm-1峰低于NB4細(xì)胞[圖8(b)]。 jurkat細(xì)胞在966，1 118，1 206，1 230和1 240 cm-1峰高于THP-1細(xì)胞，在759，842，1 031，1 050，1 485和1 538 cm-1峰低于THP-1細(xì)胞[圖8(c)]。 KG-1α細(xì)胞在826，844，962，1 119，1 155，1 206，1 548和1 596 cm-1峰高于NB4細(xì)胞，在1 227和1 243 cm-1峰低于NB4細(xì)胞[圖8(d)]。 THP-1細(xì)胞在708，842，957，1 031，1 050，1 155，1 240和1 485 cm-1峰高于KG-1α細(xì)胞，在789，826，920，966，1 206，1 258和1 415 cm-1峰低于KG-1α細(xì)胞[圖8(e)]。 THP-1細(xì)胞在826，844，957，1 050，1 155和1 313 cm-1峰高于NB4細(xì)胞，在920，1 258和1 415 cm-1峰低于NB4細(xì)胞[圖8(f)]。 歸納上述兩兩組合載荷分析得知，jurkat細(xì)胞的羥基磷灰石/類胡蘿卜素/膽固醇(957 cm-1)含量高于其他細(xì)胞，且蛋白(1 243 cm-1)含量較高，反映了淋巴細(xì)胞活躍的增殖代謝； KG-1α細(xì)胞的核酸(789 cm-1)、葡萄糖/乳酸(920 cm-1)和羥脯氨酸/酪氨酸(1 206 cm-1)含量高于其他細(xì)胞，且羥基磷灰石/類胡蘿卜素/膽固醇(957 cm-1)含量較低，反映了其活躍的與核酸相關(guān)的能量代謝； NB4細(xì)胞的葡萄糖/乳酸(920 cm-1)含量較高，且核酸(826 cm-1)、膠原/脂質(zhì)(1 313 cm-1)、羥基磷灰石(962 cm-1)和蛋白(1 155和1 548 cm-1)含量少于其他細(xì)胞，反映了其可能存在較強(qiáng)的細(xì)胞呼吸； THP-1細(xì)胞的羥基磷灰石/類胡蘿卜素/膽固醇(957 cm-1)含量較高，且核酸(1 415 cm-1)含量少。

圖8 四組細(xì)胞兩兩組合PLS-DA載荷分析圖Fig.8 Loading figure for PLS-DA model from two combinations of the four groups

圖10 四組細(xì)胞兩兩組合PLS-DA模型下聚類分析圖Fig.10 Dendrogram of cluster analysis from two combinations of the four groups using PLS-DA

2.5 四種急性白血病細(xì)胞兩兩組合聚類分析結(jié)果

運用前文所述方法從4類細(xì)胞拉曼光譜結(jié)果中隨機(jī)抽取40張?zhí)卣鞴庾V(每類10張)，組合而成四組數(shù)據(jù)資料。 由圖9、圖10可知，PCA模型下特征光譜聚類分析存在偏差，部分分組中兩類細(xì)胞被區(qū)分為兩類以上結(jié)果。 相比之下，PLS-DA模型下聚類分析能很好地將四種細(xì)胞特征光譜兩兩區(qū)分，準(zhǔn)確度可達(dá)100%。

外周血白細(xì)胞分析是血液系統(tǒng)疾病診斷檢查中的關(guān)鍵步驟，并且通常需要分子標(biāo)記。 只有詳細(xì)的表型分析才能識別細(xì)胞的特定病理階段，如白血病。 細(xì)胞的固定和化學(xué)染色對于提供對細(xì)胞生化特性的更深入了解是必要的，然而，這種標(biāo)記方法不允許科研人員研究其生理生化狀態(tài)下的細(xì)胞行為。 拉曼光譜技術(shù)以其非標(biāo)記無損檢測的優(yōu)勢，彌補(bǔ)了流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)對白血病細(xì)胞分析方法的不足，提供了一種操作簡便、價格低廉的白血病細(xì)胞生物學(xué)信息的表征方式。 本研究的目的是使用拉曼光譜技術(shù)鑒別來自四種不同白血病細(xì)胞系的白血病細(xì)胞的光譜差異，并使用這些差異來區(qū)分這四種細(xì)胞。

3 結(jié) 論

采用PCA與PLS-DA特征光譜分析相比較的方法，鑒別不同的急性白血病細(xì)胞。 雖然這些分析技術(shù)借助視覺上可描述的分?jǐn)?shù)圖提供了復(fù)雜數(shù)據(jù)集的低維表示，但是從分?jǐn)?shù)圖中推測顯微拉曼技術(shù)所展示的細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)結(jié)論，還需依靠科研工作者的的主觀檢驗。 在上述化學(xué)計量學(xué)方法基礎(chǔ)上，聚類分析佐證了PLS-DA方法的可行性和穩(wěn)定性。

綜上，共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)與PCA、PLS-DA和聚類分析等特征光譜分析方法緊密結(jié)合，可以科學(xué)檢測四種急性白血病細(xì)胞內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)、組分及含量的差異，并可以以這些差別為依據(jù)鑒別不同類型的急性白血病，具有深遠(yuǎn)的科研和臨床意義。