唐雄馳，徐慶萍，韋小榮，黃克河，江 毅，施超園，梁延連

（1.貴港市平南區(qū)人民醫(yī)院，廣西貴港 537300；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院；南寧 537000； 3.深圳市血液中心輸血醫(yī)學(xué)研究所,廣東深圳 518000）

華支睪吸蟲（又稱肝吸蟲，以下統(tǒng)稱華支睪吸蟲）的感染與流行是中國(guó)南方地區(qū)關(guān)注的流行病，其中以廣西、廣東和海南等省(自治區(qū))為華支睪吸蟲病的主要流行區(qū)。華支睪吸蟲又稱華肝蛭，成蟲寄生于人體的肝膽管內(nèi)，對(duì)人的肝膽管造成病變損害，蟲體主要攝取宿主的紅細(xì)胞與白細(xì)胞。成蟲在肝膽管內(nèi)破壞膽管上皮及黏膜下血管并不斷排出代謝產(chǎn)物和分泌有毒物質(zhì)，引起膽管內(nèi)膜及膽管周圍的超敏反應(yīng)與炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)膽管局限性的擴(kuò)張及膽管上皮增生，由于膽管壁增厚，管腔狹窄和蟲體堵塞膽管，可出現(xiàn)膽管炎與膽囊炎或阻塞性黃疸，

由于膽汁流通不暢，往往容易并發(fā)細(xì)菌感染。華支睪吸蟲的幼蟲在肝實(shí)質(zhì)移行或在腹腔器官內(nèi)移行時(shí)會(huì)刺激宿主肌體產(chǎn)生炎癥應(yīng)答，激發(fā)免疫應(yīng)答產(chǎn)生IgM與IgG抗體。病理研究表明，受華支睪吸蟲感染的膽管呈腺瘤樣病變，感染嚴(yán)重時(shí)在門脈區(qū)周圍可出現(xiàn)纖維組織增生和肝細(xì)胞的萎縮變性，甚至形成膽汁性肝硬化。廣東、廣西等地區(qū)的人群均有喜歡吃“魚生”或“生滾魚粥”的生活習(xí)慣，生吃海鮮有感染華支睪吸蟲的危險(xiǎn)[1]。有研究報(bào)道：人類的細(xì)胞因子與寄生蟲感染息息相關(guān)，細(xì)胞因子是機(jī)體受內(nèi)、外刺激而產(chǎn)生的免疫遞質(zhì)，它們既是免疫細(xì)胞的效應(yīng)分子，又是細(xì)胞間傳遞信息、相互調(diào)節(jié)的分子通路[2]。與寄生蟲相關(guān)的細(xì)胞因子主要包括白細(xì)胞介素群系（IL-1，IL-2，L-3……）、干擾素群系（IFNα，β，γ）、腫瘤壞死因子群系與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等，其中細(xì)胞黏附分子屬于跨膜糖蛋白，

這類型的跨膜糖蛋白是寄生蟲感染的受體[3-4]。另外有報(bào)道：華支睪吸蟲病人有紅細(xì)胞免疫功能方面明顯低下的癥狀，但體液免疫功能無明顯改變[5]。據(jù)此，本研究對(duì)有相同飲食習(xí)慣的廣西壯族自治區(qū)武鳴區(qū)與貴港平南區(qū)的15～65歲人群進(jìn)行了隨機(jī)篩查血清中華支睪吸蟲IgG抗體，同時(shí)對(duì)寄生蟲感染有密切關(guān)系的紅細(xì)胞跨膜糖蛋白候選基因M，N，MG，MT的頻率進(jìn)行了調(diào)查研究，報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 樣本來源以廣西壯族自治區(qū)具有相同飲食習(xí)慣（生吃魚肉）的武鳴區(qū)與貴港平南區(qū)作為代表性研究地區(qū)，隨機(jī)抽選15～65歲原居住地人群，其中武鳴區(qū)700例，貴港平南區(qū)500例，共1 200例。分別采集3ml不抗凝血與3ml抗凝全血進(jìn)行血清華支睪吸蟲IgG抗體檢測(cè)與紅細(xì)胞跨膜糖蛋白相關(guān)候選基因M，N，MG，MT的頻率調(diào)查。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：由深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)的華支睪吸蟲IgG抗體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20191103），定性檢測(cè)人血清（漿）中特異性華支睪吸蟲IgG抗體，抗體水平與感染水平呈正相關(guān)。單克隆鼠抗血清Anit-M(IgM性質(zhì)，批號(hào)：20190709)，Anit-N(IgM性質(zhì)，批號(hào)：20190428)均由上海血液生物科技有限責(zé)任公司提供，進(jìn)行MN血型鑒定并統(tǒng)計(jì)M，N基因頻率。Gentra DNA提取試劑盒（批號(hào)：106412）由美國(guó)Promega公司提供?；驕y(cè)序選用引物[6]：上游：5’-CCACATAGCAATTCTCTAAAC-3’；下游：5’-GCATTTCTCAGTGTTTGTCAC-3’進(jìn)行MG，MT基因分型與頻率調(diào)查。

1.2.2 儀器：Vranus AE120酶聯(lián)免疫分析儀，Eppendorf 9700 PCR擴(kuò)增儀，PrismTMABl3730XL測(cè)序儀，Embitec電泳儀，D77WWL-20-M凝膠成像儀，Diamed-ID 12SI卡式離心機(jī)，Diamed-ID 37SI孵育器。

1.3 方法

1.3.1 血清華支睪吸蟲IgG抗體檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果的判斷嚴(yán)格按試劑盒的步驟與要求進(jìn)行。MN血型鑒定以血型血清學(xué)的抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)MM，MN，NN血型結(jié)果，同時(shí)計(jì)算M，N的基因頻率。

1.3.2 DNA提取：使用Gentra試劑盒提取抗凝血樣的DNA，并控制DNA的濃度在80～100ng/μl范圍。

1.3.3 PCR加樣體系與擴(kuò)增條件：50μl加樣體系：10×Buffer 5μl；MgCl23μl；dNTP 4μl；正 向 與反向引物各2μl；TaqDNA聚合酶1μl；DNA模板2μl；ddH2O 31μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃×1 min，56℃×1 min，72℃×1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證：取3μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 g/dl瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段與產(chǎn)物的純度。

1.3.5 產(chǎn)物純化與測(cè)序鑒定：使用離心過濾柱法(Milliprore公司)純化擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物作為測(cè)序反應(yīng)模板，再一次擴(kuò)增，測(cè)序引物與第一次擴(kuò)增引物序列相一致，采用10μl反應(yīng)體系：正向與反向引物(終濃度為0.062 5pmol/L)各3μl；模 板DNA 1μl；ddH2O 2.0μ1；ABI Big-Dyev3.1測(cè)序反應(yīng)液4μ1。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10min；94℃變性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)后產(chǎn)物于4℃保存。以上擴(kuò)增產(chǎn)物用醋酸鈉/乙醇沉淀法提純后使用PrismTMABl3730XL基因測(cè)序儀檢測(cè)，并使用Oli6instatler分析軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析。

2 結(jié)果

通過Vranus AE120酶聯(lián)免疫分析儀對(duì)廣西壯族自治區(qū)隨機(jī)選取的武鳴區(qū)700例、貴港平南區(qū)500例共1 200例15歲至65歲人群的華支睪吸蟲血清抗體檢測(cè)，得到華支睪吸蟲IgG抗體篩查結(jié)果：武鳴區(qū)的華支睪吸蟲抗體陽(yáng)性率62.7%（439/700），貴港平南區(qū)的華支睪吸蟲抗體陽(yáng)性率3.4%(17/500)，這說明兩個(gè)區(qū)的華支睪吸蟲感染陽(yáng)性率具有明顯差異。對(duì)1 200例人群的血樣全部進(jìn)行了紅細(xì)胞跨膜糖蛋白候選基因M，N，MG，MT頻率調(diào)查，見表1。從相關(guān)的基因調(diào)查暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)與兩區(qū)人群的華支睪吸蟲感染有顯著差異。MG，MT基因分型鑒定代表圖見圖1,圖2。

表1 廣西壯族自治區(qū)武鳴區(qū)與貴港平南區(qū)的華支睪吸蟲感染調(diào)查結(jié)果

圖1 MG血型基因鑒定位點(diǎn)

圖2 MT血型基因鑒定位點(diǎn)

應(yīng)用相同的試劑與檢測(cè)儀器同時(shí)對(duì)武鳴區(qū)與貴港平南區(qū)人群的華支睪吸蟲抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，兩個(gè)地區(qū)的人群都習(xí)慣食用“魚生”或“生滾魚粥”等生吃海鮮的習(xí)慣，但兩地區(qū)的華支睪吸蟲感染程度具有明顯的不同，武鳴區(qū)的人群對(duì)華支睪吸蟲感染具有高發(fā)的現(xiàn)象，而貴港平南區(qū)的人群對(duì)華支睪吸蟲是低感染的現(xiàn)象，說明人群對(duì)華支睪吸蟲的易感性未必與飲食習(xí)慣完全相關(guān)。另外，檢測(cè)兩地區(qū)人群的紅細(xì)胞跨膜糖蛋白候選基因M，N，MG，MT基因頻率未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

3 討論

據(jù)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在亞熱帶地區(qū)生活的人群普遍都有一個(gè)共同的生活習(xí)慣：食用生的或烹飪未完全煮熟的淡水魚。大部分淡水魚類中攜帶有一種名為Clonorchis sinensis的蠕蟲，這種蠕蟲稱華支睪吸蟲，又稱肝吸蟲（liver fluke），它的成蟲寄生于人或動(dòng)物體的肝膽管內(nèi)，可引起華支睪吸蟲病（Clonorchiasis），又稱肝吸蟲病。受華支睪吸蟲（以下統(tǒng)稱華支睪吸蟲）感染的人類或動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩和各種并發(fā)性疾病：肝臟大量出血和炎癥，膽管和膽囊增厚或擴(kuò)張，較為嚴(yán)重的并發(fā)癥是誘發(fā)肝臟發(fā)生惡性腫瘤[7-8]。當(dāng)寄生蟲初步感染時(shí)，會(huì)刺激肌體最先免疫出現(xiàn)的是IgM抗體，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)IgG抗體，如果在血清中檢測(cè)到寄生蟲的IgG抗體，說明肌體有曾經(jīng)的感染史或正在感染華支睪吸蟲。因此通過血清學(xué)檢測(cè)的定性方法，可以追蹤與定性華支睪吸蟲的感染率。

研究中對(duì)我國(guó)南方地區(qū)具有相同喜好：吃“魚生”或“半生魚粥”生活習(xí)慣的廣西壯族自治區(qū)武鳴、貴港兩區(qū)進(jìn)行華支睪吸蟲的高發(fā)感染與低感染人群的頻率與相關(guān)候選基因進(jìn)行調(diào)查研究，以隨機(jī)選取的方式對(duì)武鳴區(qū)700例、貴港平南區(qū)500例共1 200例的15～65歲人群進(jìn)行華支睪吸蟲抗體IgG抗體篩查，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，每批次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性、陽(yáng)性、空白對(duì)照孔，結(jié)果顯示武鳴區(qū)的華支睪吸蟲抗體陽(yáng)性率為62.7%，貴港平南區(qū)的華支睪吸蟲陽(yáng)性率為3.4%。從數(shù)據(jù)上體現(xiàn)了具有相同飲食習(xí)慣的地區(qū)在華支睪吸蟲的易感性上具有顯著的差異。調(diào)查對(duì)像不分男性與女性，只選取15～65歲的人群，原因是同一地區(qū)或同一家庭中飲食相似，這個(gè)年齡段的人活動(dòng)范圍廣、餐中食量大等共同特點(diǎn)。根據(jù)兩區(qū)人群的高發(fā)感染與低感染率的差異，是否與不同地區(qū)人群的其他遺傳基因相關(guān)有待進(jìn)一步的深入研究。對(duì)于華支睪吸蟲感染的研究，除了血清學(xué)檢測(cè)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用外，人們逐步建立起標(biāo)準(zhǔn)化、準(zhǔn)確性高的診斷測(cè)試來識(shí)別是否受感染，還有通過分子生物學(xué)技術(shù)在基因識(shí)別和表征來鑒別感染與致病的可能性，并且把分子生物學(xué)手段介入了寄生蟲的治療：Wannaporn Ittiprasert動(dòng)物模型中，使用CRISPR/Cas9‘敲除’的基因?qū)е录纳x感染癥狀顯著減少，通過他們的研究還表明，這種革命性的生物醫(yī)學(xué)工程-CRISPR/Cas9是一項(xiàng)新技術(shù)，可以精確定位和滅活寄生蟲所產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)所需的遺傳信息[9]。另外在華支睪吸蟲感染與治療方面，可以使用CRISPR/Cas9去除編碼顆粒體的基因，使華支睪吸蟲感染的癥狀明顯減輕[9]。廣西壯族自治區(qū)武鳴與貴港平南兩區(qū)人群的寄生蟲感染相關(guān)的紅細(xì)胞跨膜糖蛋白候選基因：M，N，MG，MT基因的頻率分布結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該基因與華支睪吸蟲感染密切相關(guān)，有待增加樣本量深入鑒定寄生蟲感染受體-紅細(xì)胞跨膜糖蛋白對(duì)應(yīng)的相關(guān)基因的堿基序列，以期深入了解華支睪吸蟲對(duì)人群的易感性與耐受性。

研究發(fā)現(xiàn)，大部分的淡水魚體內(nèi)感染了華支睪吸蟲，但蝦類都不感染華支睪吸蟲[10]。所以調(diào)查喜食“魚生”或“生滾魚粥”的廣西壯族自治區(qū)武鳴與貴港平南區(qū)人群，得到的調(diào)查結(jié)果與別的地區(qū)報(bào)道有差異：中山市居民人群華支睪吸蟲總感染率為19.45%[11]；佛山市華支睪吸蟲感染率為33.89%[12]。調(diào)查結(jié)果顯示廣西武鳴區(qū)感染率與同樂鄉(xiāng)（77.85%）較為相近[13]。從數(shù)據(jù)說明，我國(guó)各個(gè)地區(qū)的人群對(duì)華支睪吸蟲的感染情況各有差異，文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果大多以人群的生活習(xí)慣：生食魚類或其他海鮮類的原因確定為易感因素。然而，在不同居住地但有相同飲食習(xí)慣的廣西壯族自治區(qū)武鳴區(qū)與貴港平南兩區(qū)的人群存在高發(fā)率與低感染率的明顯差異，這是否與人群中不同的基因或血液中的黏附因子相關(guān)有待進(jìn)一步深入研究，這項(xiàng)展望也是課題下一步探討的方向，研究結(jié)果可以為華支睪吸蟲的預(yù)防與治療打下基礎(chǔ)。