趙璐瑤 陳振婭 霍毅欣，2

（1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；2.蘇州工業(yè)園區(qū)洛加大先進(jìn)技術(shù)研究院，蘇州 215123）

硝基是強(qiáng)鈍化基，是炸藥、染料、生物醫(yī)藥和抗菌劑中常見(jiàn)的官能團(tuán)［1-2］。硝基化合物是烴分子中的氫原子被強(qiáng)電子受體-NO2取代而成的化合物，根據(jù)脂烴基或芳烴基可分為脂肪族硝基化合物（RNO2）和芳香族硝基化合物（Ar-NO2），如硝基甲烷、硝基苯。根據(jù)含硝基的數(shù)量，又可分為一元硝基化合物和多元硝基化合物，如對(duì)硝基苯（NB）、三硝基甲苯（TNT）［3］。芳香族硝基化合物因其安全性好、感度較低、能量適中，在很多領(lǐng)域［4］，尤其在炸藥制造中是一類(lèi)非常重要的原料［5］（圖1）。

圖1 硝基化合物的制備及轉(zhuǎn)化

目前，化學(xué)合成法是硝基化合物的主要合成方法［5-7］，利用硝酸和硫酸作為硝化試劑可順利得到多硝基化合物，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量含有機(jī)化合物的廢酸和廢水，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［8］。有許多優(yōu)化的硝化方法［9］，例如利用硝酸鹽等重氮鹽取代酸或者用鑭系（Ⅲ）或（Ⅳ）族金屬［10］、三氟磺酸［11］等作為催化劑，這些方法雖在一定程度上緩解了環(huán)境污染問(wèn)題，但在成本、可控性和轉(zhuǎn)化效率上仍有不足。生物酶催化高效環(huán)保，反應(yīng)條件溫和，耗能少，副產(chǎn)物少，可減少環(huán)境污染并降低分離產(chǎn)物所需成本［12］，生物酶合成法在生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本文總結(jié)了硝基及硝基化合物的功能，當(dāng)前已有的硝基化合物合成方法以及包括過(guò)氧化物酶、細(xì)胞色素P450超家族和N-加氧酶等硝化酶的研究進(jìn)展，展望了利用硝化酶催化芳香族硝基化合物的合成以及通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件、酶的定向進(jìn)化提高酶催化效率、創(chuàng)造新功能酶的發(fā)展方向。

1 硝基及硝基化合物

硝基是炸藥、染料、生物醫(yī)藥和抗菌劑等常見(jiàn)的官能基團(tuán)［1-2，13］。硝基化合物是烴分子中的氫原子被-NO2取代而成的化合物，其通式為R-NO2或Ar-NO2，如硝基甲烷、硝基苯等，其中芳香族硝基化合物尤為重要［14］。硝基化合物在生產(chǎn)和生活中具有廣泛的應(yīng)用，Abdallah等［3］證實(shí)了芳香族硝基化合物具有降低碳鋼的陽(yáng)極溶解、延緩陰極析氫反應(yīng)的作用，可用作抑制碳鋼腐蝕的混合抑制劑。Ono等［15］利用硝基烯烴與異氰酸酯反應(yīng)合成不含N的吡咯，Dryzhakov等［16］探究了硝基化合物在催化疊氮化反應(yīng)中的協(xié)同催化作用。另外，硝化反應(yīng)也是制備氨基化合物的一條重要途徑［17］，不同的還原劑可以使硝基化合物生成各種不同的中間還原產(chǎn)物［18］，且這些中間產(chǎn)物在一定條件下又可以互相轉(zhuǎn)變［19］。

2 化學(xué)硝化方法

傳統(tǒng)化學(xué)合成方法中最常見(jiàn)的是利用硝酸、硫酸等強(qiáng)酸制備硝基化合物［8］，但會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)環(huán)境有害的廢酸和廢水，且副產(chǎn)物較多［20］。為解決以上問(wèn)題，可通過(guò)改變催化劑種類(lèi)、調(diào)整酸的使用比例和使用量以及改變反應(yīng)條件等方法改進(jìn)硝基化合物的生產(chǎn)過(guò)程［21］。有些硝基化合物如鄰二硝基苯、對(duì)二硝基苯均不能由酸直接硝化，只能由鄰硝基苯胺、對(duì)硝基苯胺形成的重氮鹽與亞硝酸鈉反應(yīng)制得（圖2）［22-23］。較為理想的方法是用鑭系（Ⅲ）或（Ⅳ）族金屬［10］、三氟磺酸［11］等作為催化劑以較高產(chǎn)率催化等當(dāng)量的硝酸（69%）硝化苯環(huán)，此反應(yīng)副產(chǎn)物中沒(méi)有廢酸且催化劑可重復(fù)使用，但也存在催化選擇性較差，對(duì)設(shè)備要求高，產(chǎn)生的廢物處理過(guò)程繁瑣以及安全隱患等問(wèn)題［24］。為拓展反應(yīng)條件溫和、成本低及產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少的生物酶合成法在生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用，需要探究硝化酶的結(jié)構(gòu)和功能。

3 自然界中的硝化酶

自然界中的許多生物體可以發(fā)生硝化反應(yīng)［25］，這些硝化反應(yīng)依賴(lài)于其體內(nèi)酶的催化［26］。已報(bào)道的硝化酶大致可分為過(guò)氧化物酶、細(xì)胞色素P450家族和N-加氧酶3大類(lèi)。

3.1 過(guò)氧化物酶

過(guò)氧化物酶是一類(lèi)氧化還原酶，主要存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中，以過(guò)氧化氫或烷基過(guò)氧化物作為電子受體，可有效催化一系列底物的氧化［27-29］。微過(guò)氧化物酶（Micro-peroxidases，MPs）是細(xì)胞色素C在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下水解得到的血紅素肽鏈，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單并保留了過(guò)氧化物酶的活性。包括含血紅素的十一肽（第12-22位氨基酸殘基），即微過(guò)氧化物酶11（MP11）［30］、含血紅素的十肽（第13-22位氨基酸殘基），即微過(guò)氧化物酶10（MP10）［31］、含血紅素的九肽（第14-22位氨基酸殘基），即微過(guò)氧化物酶9（MP9）［32］和含血紅素的八肽（第14-21位氨基酸殘基），即微過(guò)氧化物酶8（MP8）［33］。其中，MP8的研究最為廣泛。Aron等［34］從馬心細(xì)胞色素C中降解MP8。Marques等［35］對(duì)MP8的水化合物有機(jī)溶液反應(yīng)進(jìn)行了全面的研究，發(fā)現(xiàn)MP8具有過(guò)氧化物酶活性，能夠氧化N-單取代羥胺。Ricoux等［36］利用MP8催化苯酚在NO2-/H2O2/MP8體系中合成鄰硝基苯酚和對(duì)硝基苯酚。MP8保留了細(xì)胞色素C第14-21位氨基酸殘基，其中C14和C17通過(guò)硫醚鍵與血紅素橋聯(lián)，鐵離子占據(jù)了His18上咪唑基團(tuán)的第六位點(diǎn)，水分子占據(jù)了軸向配位的位點(diǎn)，這使得MP8可與底物苯酚的烷基結(jié)合并形成硝基［37］。Buddea等［38］報(bào)道了大豆過(guò)氧化物酶（Soybean peroxidase，SBP）可催化無(wú)機(jī)化合物的氧化且可在過(guò)氧化氫和亞硝酸鈉的存在下催化多種酚類(lèi)的硝化。SBP具有很高的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性，這使其在工業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值［39］。Welinder等［40］得到了非糖基化的重組SBP（rSBP），通過(guò)比較氨基酸序列觀察到rSBP晶體結(jié)構(gòu)中胱氨酸與C11-C91、C44-C49、C97-C299和C176-C208氨基酸序列橋聯(lián)，這與辣根過(guò)氧化物酶C（HRPC）及其他Ⅲ型過(guò)氧化物酶的保守序列同源。通過(guò)分析酶的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)底物的結(jié)合位點(diǎn)上的TRIS緩沖分子以及高度暴露的血紅素邊緣，以及血紅素上的乙烯基與蛋氨酸的硫原子相連是該酶催化功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但至今仍未發(fā)現(xiàn)高穩(wěn)定性酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖2 對(duì)、鄰二硝基苯的合成［22-23］

3.2 細(xì)胞色素P450家族

催化有機(jī)化合物氧化的P450s中也有催化硝化反應(yīng)的酶，P450蛋白種類(lèi)的多樣性及其底物的重疊性使P450酶系可以催化多種反應(yīng)［41］。鏈霉菌可生產(chǎn)一種叫做薩克多敏E酶（Thaxtomin E，TxtE）的P450酶，該酶可催化芳烴的硝化［42］。由于獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，TxtE可能成為設(shè)計(jì)新型芳香硝基化合物催化劑的理想平臺(tái)。為了更好地了解野生型酶的結(jié)構(gòu)和功能，Yu等［43］利用Auto Dock證實(shí)了三種與色氨酸連接的構(gòu)造。Dodani等［44］通過(guò)光譜和酶-底物擬合研究，確定野生型TxtE可催化L-色氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，而這些底物需要有被修飾的吲哚側(cè)鏈和氨基酸基團(tuán)才能被硝化。

3.3 非血紅素二鐵N-加氧酶

催化硝化反應(yīng)的N-加氧酶在自然界中較為稀有，其中研究較深入的是來(lái)自土壤細(xì)菌Streptomyces thioluteus的對(duì)氨基苯基-N-加氧酶（p-aminobenzoate N-oxygenase，AurF），該酶是一種非血紅素二鐵加氧酶，催化將對(duì)氨基苯甲酸（Ar-NH2，Ar=4-羧基苯）經(jīng)由對(duì)羥氨基苯甲酸（Ar-NHOH）、對(duì)亞硝基苯甲酸（Ar-NO）轉(zhuǎn)化為對(duì)硝基苯甲酸（Ar-NO2）［45］。Choi等［46］分析了AurF的電子傳遞機(jī)制，證實(shí)了AurF是由兩個(gè)鐵離子而非錳離子傳遞電子，并實(shí)現(xiàn)了AurF的體外酶促反應(yīng)（圖3）［47］。與AurF同源的另一非血紅素二鐵酶（α-N-dichloroacetyl-p-aminophenylserinol N-oxygenase，CmlI）也具有催化氨基氧化的作用［48-49］。Lu等［50］首次報(bào)道了N-加氧酶CmlI的生化特性以及在氯霉素（Chloramphenicol，CAM）生物合成中的作用。CAM生物合成的最后一步是CmlI將D-蘇式-1-（4-氨基苯基）-2-二氯乙酰氨基-1，3-丙二醇（NH2-CAM）的芳胺功能團(tuán)氧化為硝基。生物信息學(xué)分析結(jié)構(gòu)表明，CmlI與AurF中34%的氨基酸序列相同且均含有雙鐵氧合酶中特有的EX28e37DEXXH基序。Knoot等［51］在研究中報(bào)道了AurF第197-201的氨基酸序列處有一段非α-螺旋結(jié)構(gòu)，而CmlI在該處仍為α-螺旋。這些結(jié)構(gòu)上的特征為進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)工程工具進(jìn)行此類(lèi)加氧酶和生物催化劑的機(jī)理和結(jié)構(gòu)研究打開(kāi)了大門(mén)。此外，氨基吡咯菌素-N-加氧酶（Monodechloroaminopyrrolnitrin synthase，PrnD）也是一種非血紅素鐵酶，可催化氨基吡咯尼林轉(zhuǎn)化為吡咯尼林［52］。作為Rieske蛋白，PrnD的2Fe-2S中心和單核鐵位點(diǎn)在進(jìn)化上是保守的，與該酶的2Fe-2S中心配位的C69、H71、C88和H91以及與非血紅素鐵表面配位的3個(gè)氨基酸殘基H186、H191和D323可避免線性序列的形成并保證酶的催化活性［53］。

圖3 AurF結(jié)構(gòu)分析［46］

4 天然酶的定向改造

天然酶因其本身存在缺陷而難以滿足人們的需求。在實(shí)際生產(chǎn)中，為得到所需特性的酶，需要分析酶活性區(qū)域的結(jié)構(gòu)，改變酶的活性口袋進(jìn)而提高其催化活性并拓寬底物范圍。表1中總結(jié)了已報(bào)道的硝化酶的改造位點(diǎn)及效果。

4.1 TxtE酶的結(jié)構(gòu)分析與改造

為驗(yàn)證TxtE酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，Yu等［43］設(shè)計(jì)了5個(gè)單殘基突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TxtE與L-色氨酸結(jié)合的分子對(duì)接模型，將R59、N293、T296、E394突變?yōu)榱涟彼?，Y89突變?yōu)楸奖彼岷?，發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)氨基酸對(duì)L-色氨酸具有極性作用。為識(shí)別底物與突變體的結(jié)合情況，在含野生型TxtE的反應(yīng)體系中加入L-色氨酸后，觀察血紅素紫外-可見(jiàn)光譜的變化，發(fā)現(xiàn)390 nm處的吸收增加，420 nm處的吸收減少，而突變體TxtE-R59L、TxtE-T296L和TxtEE394L在添加L-色氨酸后未見(jiàn)移位，突變體TxtEY89F和TxtE-N293L仍能與L-色氨酸結(jié)合，但結(jié)合能力明顯下降，說(shuō)明R59、T296和E394是L-色氨酸結(jié)合所必需的氨基酸。TxtE-Y89F和TxtE-N293L的解離常數(shù)（Kd）分別為120.63 ± 4.30 μmol/L和1.70±0.28 μmol/L，而 野 生 型TxtE的Kd值 為43.59±2.26 μmol/L。因此，N293也可能是結(jié)合L-色氨酸的關(guān)鍵殘基。為提高酶的催化活性，Zuo等［54］構(gòu)建了15個(gè)TxtE融合體。將TxtE的JK環(huán)與P450BM3的JK環(huán)進(jìn)行交換，調(diào)整TxtE與BM3R之間的連接肽長(zhǎng)度（圖4）并獲得多個(gè)融合體，其中TB14（連接肽長(zhǎng)度為14個(gè)氨基酸）催化活性明顯高于TxtE，且底物范圍廣，可催化4-F-5-NO2-L-Trp和4-Me-7-NO2-L-Trp的合成。TB14在生物醫(yī)學(xué)和生物應(yīng)用領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景，是開(kāi)發(fā)硝化生物催化劑、通過(guò)蛋白質(zhì)工程合成結(jié)構(gòu)多樣的芳香族硝基化合物的理想材料。

表1 硝化酶的改造及效果

圖4 含有長(zhǎng)度可變的連接肽或交換環(huán)（黃色）的TxtEBM3R嵌合體結(jié)構(gòu)示意圖［54］

Saroay等［55］進(jìn)一步研究并發(fā)現(xiàn)TxtE對(duì)吲哚環(huán)取代等底物修飾具有耐受性，為提高底物的轉(zhuǎn)化率并擴(kuò)大底物范圍，他們對(duì)22個(gè)位點(diǎn)飽和文庫(kù)進(jìn)行了天然底物篩選，得到了R59X突變體，該突變體催化色氨酸生成4-硝基色氨酸的轉(zhuǎn)化率比野生型提高了3.5倍。Gober等［56］通過(guò)在H176位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變以探索氨基酸殘基的替換對(duì)區(qū)域選擇性的影響，多數(shù)突變體的活性顯著降低甚至完全失活，但也發(fā)現(xiàn)少數(shù)突變體的催化活性提高或者催化位點(diǎn)改變。如將H176替換為為天冬酰胺，甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸或蛋氨酸后，酶可以催化4-和5-硝基色氨酸的合成，替換為苯丙氨酸、酪氨酸則只在色氨酸的C5位產(chǎn)生硝化作用。硝基色氨酸及其類(lèi)似物是合成生物活性和生物技術(shù)相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)、材料和蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)材料，對(duì)TxtE底物范圍和區(qū)域特異性的分子決定因素的結(jié)構(gòu)和機(jī)制的研究，可擴(kuò)展對(duì)酶的基本理解，有利于指導(dǎo)進(jìn)一步的工程研究。

4.2 非血紅素二鐵N-加氧酶的結(jié)構(gòu)分析與改造

Lee等［53］為探討熒光假單胞菌Pf-5中氨基吡咯硝基加氧酶（PrnD）底物特異性的決定因素。采用分子模擬和突變分析（定點(diǎn)誘變和飽和誘變）方法推測(cè)出17個(gè)可能與底物接觸的氨基酸殘基，其中第312位和277位氨基酸殘基可以單獨(dú)或共同調(diào)節(jié)酶底物的特異性。通過(guò)用丙氨酸或纈氨酸取代這些氨基酸來(lái)探討它們?cè)诘孜锾禺愋灾械淖饔茫瑴y(cè)定不同突變體對(duì)底物Aprn的催化活性并與野生型酶對(duì)底物的催化活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)多數(shù)突變體活性顯著下降，該結(jié)果證明這些氨基酸對(duì)PrnD的底物特異性或催化活性的重要性。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)F312A和L277A突變體催化底物Aprn的轉(zhuǎn)化效率分別提高了4.89倍和3.28倍，當(dāng)這兩個(gè)突變組合在一起時(shí)，F(xiàn)312A和L277A突變體表現(xiàn)出累積效應(yīng)，并對(duì)底物Aprn的催化活性進(jìn)一步提高。Zocher等［57］通過(guò)模擬AurF與底物pABA復(fù)合物的模型分析了AurF的保守序列，改變AurF活性位點(diǎn)的氨基酸，并分別測(cè)定了突變體及野生型的體內(nèi)酶活。將R96突變?yōu)楸彼釙r(shí)，AurF對(duì)pABA的催化活性完全消失，說(shuō)明R96是決定酶催化功能的重要氨基酸（圖5）。將T100替換成亮氨酸，酶活性急劇下降，說(shuō)明T100對(duì)酶的活性具有重要作用。相反，將T100替換為丙氨酸后酶活性可提高3倍，F(xiàn)264替換為丙氨酸酶活性幾乎無(wú)變化，這可能由于丙氨酸與pABA間仍存在聯(lián)系。L202替換為苯丙氨酸酶活性提高了3-4倍，這可能由于與苯丙胺酸sp2 Cδ原子共同釋放的L202 sp3 Cδ原子使酶與底物之間的聯(lián)系更加緊密。這些突變體的活性驗(yàn)證了AurF的底物結(jié)合模型（圖5），基于酶結(jié)構(gòu)可利用AurF的定向改造，使其成為一種功能更加完善的生物催化劑。另外，Choi等［46］驗(yàn)證了AurF可催化氨基芳烴的連續(xù)氧化，該酶由主要結(jié)構(gòu)為α螺旋的單體A和單體B組成的同源二聚體，并結(jié)合生化和結(jié)構(gòu)分析證明AurF是一種非血紅素二鐵加氧酶。蛋白殘基 E101、E136、H139、E196、H223、E227和H230通過(guò)配位鍵與兩個(gè)鐵離子連接形成活性中心。此外，還報(bào)道了氧化狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)及與產(chǎn)物pNBA的共晶結(jié)構(gòu)。這為進(jìn)一步研究AurF的催化機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖5 使用已建模的底物pABA（綠色）觀察AurF亞基活性中心的立體結(jié)構(gòu)［57］

5 硝化酶的應(yīng)用實(shí)例

抗生素吡咯尼特林及多拉菌素的生物合成是酶催化芳胺氧化的最典型的實(shí)例［58］。大腸桿菌可表達(dá)與吡咯尼林生產(chǎn)相關(guān)的4種功能不同的酶PrnA、PrnB、PrnC和PrnD［59］。Pée等［60］提出了吡咯尼林的生物合成途徑，首先PrnA催化色氨酸生成7-氯色氨酸，然后吲哚環(huán)重排形成苯基吡咯環(huán)并在PrnB的作用下脫羧生成單氯氨吡咯尼林，經(jīng)PrnC二次氯化生成氨基吡咯尼林，最后PrnD催化氨基吡咯尼林（Aprn）的氨基氧化成硝基，形成吡咯尼林。此外，He等［61］驗(yàn)證了聚酮合成酶（PKS）以對(duì)硝基苯甲酸（pNBA）為反應(yīng)前體這一特有功能，利用AurF通過(guò)N-氧化作用催化對(duì)氨基苯甲酸得到合成多拉菌素的前體pNBA，并進(jìn)一步在PKS的作用下合成終產(chǎn)物多拉菌素。

6 總結(jié)與展望

本文首先綜述了硝基基團(tuán)以及硝基化合物的重要作用，總結(jié)了硝基化合物（主要為芳香族硝基化合物）合成方法的種類(lèi)以及合成工藝的缺陷。另外，提供了生物酶合成化工產(chǎn)品的新思路，總結(jié)了硝化酶（p450超家族、過(guò)氧化物酶以及N-加氧酶）的研究進(jìn)展，歸納了通過(guò)改變酶的活性口袋進(jìn)而提高酶的催化活性并拓寬底物范圍的研究方法，為解決化工生產(chǎn)中面臨生產(chǎn)效率低、安全性低、轉(zhuǎn)化效率低以及高成本、高污染和高設(shè)備要求等關(guān)鍵問(wèn)題提供了思路。盡管對(duì)硝化酶研究大多還停留在酶的結(jié)構(gòu)分析、催化機(jī)理和酶的活性及穩(wěn)定性的優(yōu)化上，在實(shí)際應(yīng)用中的例子十分罕見(jiàn)，但硝化酶在生產(chǎn)領(lǐng)域中將會(huì)帶來(lái)十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及廣闊的發(fā)展空間，可通過(guò)以下幾種方法來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)展研究：（1）通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬，分析酶和底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，明確碳硝化酶的底物催化識(shí)別機(jī)制，對(duì)活性口袋關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變，實(shí)現(xiàn)氮硝化酶的定向進(jìn)化；（2）將催化硝化反應(yīng)的酶與其他有利功能的酶的表達(dá)基因進(jìn)行重組，從而表達(dá)出全新催化功能的融合酶；（3）進(jìn)一步挖掘自然界中的微生物酶源，從而獲得更多具有催化芳香族硝化的酶。其中，前兩種方法都是從結(jié)構(gòu)上對(duì)酶進(jìn)行改造，從而創(chuàng)造出一種符合人們期望的具有新的催化活性的酶。硝化酶的研究和改造可為進(jìn)一步擴(kuò)大酶的生產(chǎn)，為生物法取代傳統(tǒng)化學(xué)方法制備炸藥、醫(yī)藥、染料等奠定基礎(chǔ)。