李樹磊 鄭紅艷 王磊

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

隨著全球人口數(shù)量增加、氣候變化、土壤流失和水資源缺失等問(wèn)題日益突出，到2050年，全球?qū)Z食的需求預(yù)計(jì)將比2005年增加100%-110%［1］。為滿足人們對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)品日益增長(zhǎng)的需求，作物育種技術(shù)創(chuàng)新顯得尤為重要。雜交育種、突變育種和轉(zhuǎn)基因育種是目前現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中作物改良的主要方法，然而雜交育種需要年限較長(zhǎng)［2］，突變育種的隨機(jī)性較大［3］，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可通過(guò)引入外源基因從而獲得優(yōu)良性狀，但其商業(yè)化與監(jiān)管過(guò)程比較繁瑣［4］?；蚓庉嫾夹g(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，通過(guò)不斷地改進(jìn)，該技術(shù)現(xiàn)已成為一種操作簡(jiǎn)單、快速高效、成本低的靶向編輯基因工具，運(yùn)用基因編輯技術(shù)可以對(duì)作物自身基因進(jìn)行精確刪除或者插入以培育新品種，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。本文描述了3種基因編輯技術(shù)的原理，并對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能、局限性以及其在作物育種上的應(yīng)用做出詳細(xì)總結(jié)，最后對(duì)基因編輯作物的未來(lái)進(jìn)行展望，旨在為該技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用提供借鑒和新思路。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展

目前成熟應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)主要有3種，按時(shí)間順序依次為：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和RNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas技術(shù)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas），以下主要對(duì)3種技術(shù)的組成和作用原理做簡(jiǎn)要介紹。

1.1 鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）

鋅指核酸酶（ZFNs）具有單獨(dú)的DNA結(jié)合域和DNA裂解域，即鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）與天然IIS型限制酶Fok I，且已被廣泛應(yīng)用于靶向基因研究［5］。ZFNs誘導(dǎo)的雙鏈斷裂受到細(xì)胞DNA修復(fù)過(guò)程的影響，從而導(dǎo)致靶向突變和靶向基因置換的頻率都非常高。

鋅指蛋白是一類通過(guò)Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域去結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子。其中該結(jié)構(gòu)域每30個(gè)氨基酸結(jié)合一個(gè)鋅原子，該轉(zhuǎn)錄因子是由一個(gè)α螺旋和兩個(gè)反向的β平行形成緊密的β-β-α結(jié)構(gòu)，能特異性識(shí)別3個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)，ZFNs可以通過(guò)設(shè)計(jì)鋅指結(jié)構(gòu)域以及多個(gè)鋅指蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)特異的基因進(jìn)行編輯［6-9］。天然IIs型限制酶Fok I具有物理上可分離的結(jié)合和裂解活性，其中裂解域沒(méi)有明顯的序列特異性，且Fok I核酸酶需要形成二聚體才可切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs）［10-11］。

該技術(shù)靶向結(jié)合效率高，但由于蛋白設(shè)計(jì)復(fù)雜且篩選過(guò)程很漫長(zhǎng)，且該技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)任意靶基因的結(jié)合與高通量編輯基因，所以該方法仍在不斷完善中。

1.2 轉(zhuǎn)錄激活物效應(yīng)核酸酶技術(shù)（TALENs）

轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）技術(shù)是繼ZFNs之后的一種高效靶向基因編輯新技術(shù)，類似于ZFNs，TALENs包含一個(gè)識(shí)別特異DNA序列的TALEs（Transcription-activator-like effectors，TALEs）蛋白和非特異性的Fok I核酸酶，由兩個(gè)TALEs蛋白識(shí)別和結(jié)合DNA靶位點(diǎn)，同時(shí)Fok I核酸酶對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組靶位點(diǎn)的編輯［12］。

用于設(shè)計(jì)TALEs蛋白的基本結(jié)構(gòu)域是一個(gè)高度保守的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，TALEs蛋白的DNA結(jié)合域由33-35個(gè)氨基酸的重復(fù)單元組成，其中位于12和13位的兩個(gè)可變氨基酸殘基稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（Repeat variable di-residue，RVD），通過(guò)這兩個(gè)氨基酸殘基識(shí)別并結(jié)合DNA序列［13］。

TALENs的裂解DNA的能力幾乎與ZFNs的相同，且設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單，特異性較強(qiáng)。但TALEs蛋白的同源重復(fù)序列較多，組裝的工作量較大。且TALEs蛋白的體積幾乎是ZFPs的3-4倍，對(duì)轉(zhuǎn)化手段具有一定的限制，同樣也限制該技術(shù)在高通量編輯上的應(yīng)用［14］。

1.3 規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)相關(guān)蛋白技術(shù)（CRISPR/Cas）

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中存在的一種適應(yīng)性免疫反應(yīng)，其主要作用為抵御噬菌體病毒和外源質(zhì)粒DNA的入侵。

目前有3種CRISPR系統(tǒng)被驗(yàn)證，分別是TypeⅠ型基因（特征基因Cas3）、TypeⅡ型（特征基因Cas9）和TypeⅢ型（特征基因Cas10），每一種系統(tǒng)都使用一組獨(dú)特的Cas蛋白和crRNA進(jìn)行CRISPR干擾。其中I型和III型系統(tǒng)利用大型復(fù)合Cas蛋白質(zhì)與復(fù)雜的crRNA結(jié)合去編輯目標(biāo)序列［15］，而II型CRISPR系統(tǒng)只需依賴1個(gè)Cas9核酸酶及2個(gè)RNA，即crRNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）和tracrRNA（trans-activating RNA，tracrRNA），就可以造成基因的雙鏈斷裂［16］。

基于以上CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)良特性，該系統(tǒng)現(xiàn)已逐步改良為一個(gè)由RNA引導(dǎo)靶向編輯DNA的平臺(tái)，廣泛用于基因編輯、轉(zhuǎn)錄干擾和表觀遺傳調(diào)節(jié)等方面。在實(shí)際應(yīng)用中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通常包含一個(gè)Cas9蛋白和一段根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的大約100 nt的sgRNA（simple guide RNA，sgRNA）序列，Cas9核酸酶在gRNA的引導(dǎo)下對(duì)DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行切割產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂。而DNA的雙鏈斷裂可以通過(guò)非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（Homology recombination，HR）兩種方式進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)目的性編輯。

盡管運(yùn)用ZFNs和TALENs技術(shù)已經(jīng)在多種動(dòng)物及植物中成功實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)編輯，但這兩種技術(shù)定向打靶依賴于特異性結(jié)合蛋白的合成，操作起來(lái)繁瑣費(fèi)時(shí)且打靶效率低，致使其應(yīng)用進(jìn)展緩慢，而CRISPR/Cas技術(shù)具備操作簡(jiǎn)單、周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展，因此本文主要對(duì)CRISPR/Cas技術(shù)的作用方式及其在作物育種中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為農(nóng)作物品種改良提供有益的參考。

2 CRISPR/Cas的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要是通過(guò)sgRNA與Cas蛋白起作用，而通過(guò)修飾以上兩部分，CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用將被不斷拓寬。

2.1 靶向基因敲除（Knock-out）及敲入（Knock-in）

Cas9在gRNA的引導(dǎo)下，識(shí)別靶序列的PAM（protospacer adjacent motif，PAM）位點(diǎn)并切割靶位點(diǎn)，DNA斷裂引起的修復(fù)主要以NHEJ的方式修復(fù)。但NHEJ是一種易出錯(cuò)的修復(fù)方式，會(huì)在雙鏈斷裂的位置引入小的核酸插入或缺失（Insertion and deletion，indel），導(dǎo)致靶基因蛋白翻譯產(chǎn)生移碼突變，從而破壞基因功能。如果細(xì)胞中有與靶位點(diǎn)序列同源的DNA供體（DNA donor）片段時(shí)，位于供體DNA上的基因片段會(huì)通過(guò)同源重組方式整合到雙鏈斷裂的位置，從而實(shí)現(xiàn)目的片段敲入/替換［17］。

2.2 單堿基編輯

現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)兩類DNA堿基編輯器，胞嘧啶堿基編輯器（Cytidine base editing，CBE）將C·G堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為T·A堿基對(duì)，腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editing，ABE）將A·T堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為G·C堿基對(duì)。總的來(lái)說(shuō)，CBE和ABE可以實(shí)現(xiàn)所有4種可能的過(guò)渡突變（C到T，G到A，A到G，T到C）［18］。

胞嘧啶堿基編輯（CBE）：一種APOBEC1（Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 1）胞苷脫氨酶可以通過(guò)脫氨基將胞嘧啶的外環(huán)胺生成尿嘧啶［19］，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），進(jìn)而通過(guò)DNA復(fù)制或者修復(fù)的方式轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T）?；诖嗽恚撓到y(tǒng)不斷優(yōu)化。到目前為止，CBE3系統(tǒng)通過(guò)APOBEC1胞苷脫氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制劑（Uracil glycosylase inhibitor，UGI）及nCas9-D10A（Cas9 nickase，nCas9）突變體的融合表達(dá)，已成功在小麥、水稻、玉米等物種上實(shí)現(xiàn)安全高效的C到T的堿基替換編輯，且堿基替換與刪除出現(xiàn)的概率很低［20］。

腺嘌呤堿基編輯（ABE）：ABE由來(lái)自大腸桿菌（Escherichia coli）中的腺苷酸脫氨酶（tRNA adenosine deaminase enzyme，TadA）的突變體TadA*和nCas9-D10A突變體組成，TadA*可將腺嘌呤（A）脫氨變?yōu)榧≤眨↖nosine，I），肌苷（I）在DNA復(fù)制時(shí)被識(shí)別為鳥嘌呤（G），最終實(shí)現(xiàn)A到G的變換。經(jīng)過(guò)不斷的進(jìn)化改造，ABE7.10系統(tǒng)是目前報(bào)道的效率最高且與應(yīng)用最廣的ABE系統(tǒng)［16，21］。

2.3 DNA-free編輯

不同于常規(guī)植物基因組編輯的轉(zhuǎn)化手段，DNA-free編輯是指通過(guò)粒子轟擊或者PEG介導(dǎo)的方式將CRISPR/Cas9的體外轉(zhuǎn)錄物（Delivering in vitro transcripts，IVTs）或核糖核蛋白復(fù)合物（Ribonucleoprotein complexes，RNPs）直接轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞完成對(duì)靶基因的編輯。DNA-free的編輯系統(tǒng)不僅消除CRISPR/Cas9隨機(jī)整合到基因組DNA中的幾率，而且改良了常規(guī)轉(zhuǎn)化中存在的問(wèn)題，如較高的潛在脫靶效應(yīng)、易出現(xiàn)嵌合體、需通過(guò)后代分離方可獲得無(wú)CRISPR/Cas9的植物突變體。

2.4 RNA編輯

RNA編輯的主要優(yōu)點(diǎn)在于不改變編碼基因本身，更加可控、不會(huì)遺傳且效率較高（同時(shí)靶向編輯多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本）。2014年，Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Cas9酶可與PAM序列共同作用，識(shí)別并結(jié)合到單鏈RNA（Single-stranded RNA，ssRNA）的特異位點(diǎn)上［22］。隨后，張鋒團(tuán)隊(duì)從多種細(xì)菌中找到一種能夠切割大腸桿菌報(bào)告基因的Cas13a酶，開發(fā)出由單一RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas13a系統(tǒng)（也稱為CRISPR/C2c2），該系統(tǒng)可特異性的降低哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)源RNA和報(bào)告RNA水平［23］。最近，美國(guó)芝加哥大學(xué)的Dickinson研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建出一套以CRISPR/Cas為基礎(chǔ)的RNA靶向系統(tǒng)（CRISPR-Casinspired RNA targeting system，CIRTS），可將一系列效應(yīng)因子（包括核酸酶、降解機(jī)制、翻譯激活因子和堿基編輯器）傳遞到目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上［24］。

通過(guò)活性位點(diǎn)突變及與其他功能性蛋白進(jìn)行融合，該技術(shù)已經(jīng)能夠成功對(duì)RNA進(jìn)行單堿基編輯。在哺乳動(dòng)物中使用的RNA單堿基編輯融合蛋白均來(lái)源于ADAR家族腺苷脫氨酶，該酶的脫氨基域（Deamination domain，DD），即ADARDD，能催化水解腺苷（A）脫氨，將腺苷（A）轉(zhuǎn)化為肌苷（I）［25-26］。張鋒團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了REPAIR系統(tǒng)（RNA Editing for Programmable A to I Replacement，REPAIR），該系統(tǒng)將以RNA為導(dǎo)向的dCas13b，即dPspCas13b，融合到ADAR2DD（E488Q）突變體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了腺苷（A）替換至肌苷（I），而肌苷（I）在堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)行使鳥苷（G）的作用，從而造成A到I到G的轉(zhuǎn)變［27］。最近該團(tuán)隊(duì)在REPAIR的基礎(chǔ)上，對(duì)ADAR2進(jìn)行改進(jìn)，構(gòu)建出新的RNA編輯系統(tǒng)RESCUE（RNA Editing for Specific C-to-U Exchange，RESCUE），使ADAR2腺苷脫氨酶具備將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）的能力，實(shí)現(xiàn)了C到U的RNA編輯，且該系統(tǒng)仍保留將A轉(zhuǎn)化為I的功能［28］。

2.5 其他應(yīng)用

通過(guò)改良編輯系統(tǒng)的不同部分，還可以將CRISPR的應(yīng)用繼續(xù)擴(kuò)展，比如通過(guò)Cas9或其變體與不同效應(yīng)因子連接可以實(shí)現(xiàn)基因定位［29］、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［30］、表觀修飾［31］與活細(xì)胞成像［32］，還可以進(jìn)行基因組以及藥物篩選［33-34］。

3 CRISPR/Cas在作物育種上的運(yùn)用

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種的目標(biāo)主要是培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗蟲抗病的品種，傳統(tǒng)育種周期漫長(zhǎng)，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用又受各種風(fēng)險(xiǎn)因素限制。近年來(lái)，我國(guó)已在作物分子育種方面積累了一定的成果，現(xiàn)已在不同作物當(dāng)中鑒定并分離克隆大量產(chǎn)量、品質(zhì)、抗除草劑、抗蟲抗病、代謝調(diào)控和抗非生物逆境脅迫相關(guān)的基因，這些基因的有效利用將推動(dòng)作物育種的快速發(fā)展，而CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)具有高效的定點(diǎn)編輯能力，可實(shí)現(xiàn)更為可控且準(zhǔn)確的基因組編輯，所以該技術(shù)在作物育種方面具有廣闊應(yīng)用前景。

3.1 提高產(chǎn)量

作物育種最主要的目的就是提高產(chǎn)量，產(chǎn)量指標(biāo)的構(gòu)成主要包括穗數(shù)、每穗實(shí)收粒數(shù)及粒重。水稻中的miR396e和mi396f是水稻株型和粒重的重要調(diào)控基因［35-37］，朱健康團(tuán)隊(duì)通過(guò)基因敲除獲得miR396e/f的雙突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體穗型增大，千粒重增加40%左右［38］。

DEP1（Dense and erect panicle 1）是控制水稻穗粒數(shù)的顯性基因，在我國(guó)北方主栽粳稻品種中，當(dāng)DEP1基因在第5個(gè)外顯子上存在625個(gè)堿基對(duì)的缺失，表現(xiàn)為莖頂端分生組織活性提高，株高變矮，枝梗數(shù)和穗粒數(shù)增加，產(chǎn)量提高［39］。Wang等［40］通過(guò)設(shè)計(jì)4個(gè)sgRNAs在秈稻（自交系IR58025B）中實(shí)現(xiàn)該基因的大片斷敲除，得到具有密集直立圓錐花序、株高降低且具有增產(chǎn)潛力的水稻材料。

GW2（grain weight 2，GW2）基因編碼E3泛素鏈接酶，在水稻、玉米、小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用，Wang等［41］利用CRISPR/Cas9對(duì)小麥籽粒重基因TaGW2進(jìn)行敲除，突變體籽粒大小和千粒重明顯增加；同年，高彩霞與王道文團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)分別靶向3個(gè)同源基因TaGW2-A1、-B1和-D1的特異性區(qū)域，創(chuàng)制了4個(gè)TaGW2的突變體材料：TaGW2-B1和TaGW2-D1的單突變體、TaGW2-B1和-D1的雙突變體以及TaGW2-A1、-B1、-D1的三突變體。比較發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因均負(fù)調(diào)控小麥籽粒的寬度、長(zhǎng)度、千粒重及平均單株產(chǎn)量，且TaGW2-B1的作用效果強(qiáng)于TaGW2-D1［42］。

3.2 改善品質(zhì)

隨著人們生活水平的提高，要求培育的新品種作物不僅具有更高、更穩(wěn)的產(chǎn)量，而且應(yīng)該具有更好、更全面的產(chǎn)品品質(zhì)。

花青素屬于生物類黃酮物質(zhì)，是在自然界廣泛存在與植物中的天然水溶性色素，其最主要的生理性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。富含原花青素和花青素的野生稻（Oryza rufipogon L.）籽粒顯紅色，該性狀受到Rc和Rd兩個(gè)互補(bǔ)基因的調(diào)節(jié)［43-44］，Rc編碼一個(gè)基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，而Rd編碼一個(gè)二氫黃酮醇4還原酶蛋白。野生稻的RcRd基因型能夠產(chǎn)生紅色籽粒的表型，而大部分栽培水稻因Rc基因外顯子堿基缺失造成移碼突變，籽粒呈白色。福建農(nóng)科院與廈門大學(xué)合作利用CRISPR/Cas9將原本移碼突變轉(zhuǎn)換為突變堿基為三的倍數(shù)的整碼突變（in-frame mutation），致使該基因恢復(fù)功能，并得到了有較高的原花青素和花青素含量的紅稻［45］。

亞油酸是一種對(duì)心腦血管健康有害的多不飽和脂肪酸，而FAD2蛋白的作用便是將籽粒中的油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸，通過(guò)突變?cè)摶虮憧蓽p少亞油酸的含量［46］。Okuzaki［47］等通過(guò)CRISPR/Cas9以FAD2（fatty acid desaturase 2，F(xiàn)AD2）位點(diǎn)BnaA.FAD2.a為靶點(diǎn)對(duì)多倍體油菜進(jìn)行定點(diǎn)誘變，從回交子代中選擇FAD2 - aa等位基因的突變植株，在自交子代中篩選到純合植株。與野生型油菜相比，該純合突變體材料籽粒當(dāng)中油酸含量增加，亞油酸含量減少。

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）是健康人體小腸內(nèi)難以消化吸收的淀粉及淀粉降解物的總稱，攝入高抗性淀粉食品可有效預(yù)防和控制糖尿病，并對(duì)肥胖癥和腸道疾病起到積極預(yù)防作用［48］。淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）是水稻淀粉合成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控酶之一，夏蘭琴團(tuán)隊(duì)運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)SBEII進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)，直鏈淀粉和抗性淀粉含量分別提高到25%和9.8%［49］。

3.3 除草劑的耐受性與抗性

通過(guò)外源基因?qū)胧谦@得抗除草劑作物的傳統(tǒng)方法，但因?yàn)槭菍儆谵D(zhuǎn)基因作物，其在重要糧食作物中的推廣應(yīng)用受到限制，因此通過(guò)基因編輯提高重要農(nóng)作物的除草劑抗性成為目前基因組編輯研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

草甘膦是目前世界上使用量最大的除草劑，目前生產(chǎn)上推廣的抗草甘膦作物，幾乎全部為通過(guò)導(dǎo)入農(nóng)桿菌屬的CP4菌株的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因，即EPSPS（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）基因獲得的，商業(yè)化受到極大的阻礙。高彩霞和李家洋團(tuán)隊(duì)合作利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)方式在水稻中實(shí)現(xiàn)了EPSPS基因的定點(diǎn)替換，在T0代獲得對(duì)草甘膦具有抗性的水稻材料［50］。

小麥遺傳背景復(fù)雜，利用傳統(tǒng)的育種方式培育抗除草劑品種具有一定的難度。高彩霞、姜臨建和李家洋團(tuán)隊(duì)合作利用單堿基編輯技術(shù)對(duì)小麥乙酰乳酸合成酶基因（Acetolactate synthase，ALS）和乙酰輔酶A羧基化酶基因（Acetyl CoA carboxylase，ACC）進(jìn)行編輯，獲得耐受磺酰脲類、咪唑啉酮類和芳氧基苯氧基丙酸酯類除草劑的小麥材料［51］。同樣，揚(yáng)州大學(xué)和上海師范大學(xué)團(tuán)隊(duì)合作利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的胞嘧啶堿基編輯技術(shù)，成功在油菜乙酰乳酸合成酶基因BnALS中引入P197S和P197F的突變，創(chuàng)制出苯磺隆除草劑抗性的油菜［52］。近日，高彩霞和李家洋團(tuán)隊(duì)再次合作設(shè)計(jì)了可以飽和突變并促進(jìn)植物基因定向進(jìn)化的基因編輯器STEME（Saturated targeted endogenous mutagenesis editors，STEME），并利用20個(gè)sgRNA在水稻原生質(zhì)體中對(duì)乙酰輔酶A羧基化酶基因ACC的CT結(jié)構(gòu)域的168個(gè)堿基序列產(chǎn)生了接近飽和的誘變，并篩選得到與除草劑分子結(jié)合能力減弱的氨基酸突變體材料，從而成功獲得了水稻對(duì)除草劑的抗性［53］。

水稻OsSF3B1（Splicing factor 3b subunit 1，S3B-1）是一個(gè)真核細(xì)胞物種保守基因，植物中自然產(chǎn)生的剪接抑制劑在RNA剪接中起到非常重要的作用［54-55］。在農(nóng)作物中，RNA剪接抑制劑是一種有效的除草劑［56］。Butt等［57］運(yùn)用CRISPR技術(shù)對(duì)水稻OsSF3B1基因的保守結(jié)構(gòu)域HR15-17進(jìn)行突變，經(jīng)過(guò)除草劑的篩選，最終獲得了21株抗除草劑的水稻植株。

3.4 抗蟲性

植物當(dāng)中5-羥色胺和水楊酸的生物合成來(lái)自共同的源頭物質(zhì)［48］。浙江大學(xué)等單位以水稻為材料，發(fā)現(xiàn)兩者的生物合成存在相互負(fù)調(diào)控現(xiàn)象，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控植株體內(nèi)5-羥色胺生物合成，水稻會(huì)對(duì)害蟲表現(xiàn)抗性。細(xì)胞色素P450基因CYP71A（cytochrome P-450LXXIA1，CYP71A）編碼5-羥色胺，該團(tuán)隊(duì)利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9技術(shù)突變CYP71A，快速篩選培育出了抗褐飛虱、抗螟蟲的非轉(zhuǎn)基因水稻材料［58］。

3.5 非生物脅迫抗性

高溫、寒冷、干旱和重金屬毒害等非生物脅迫對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要因素，應(yīng)用基因工程方法提高作物對(duì)非生物脅迫的耐受能力，是作物分子育種面臨的重要挑戰(zhàn)之一。

鎘（Cadmium，Cd）是對(duì)人體有害的一種重金屬，會(huì)引發(fā)骨質(zhì)疏松、腎功能衰竭、癌癥及心血管疾病等［59］。鎘超標(biāo)的大米是膳食鎘攝入的主要來(lái) 源［60-61］。OsNramp5（Natural resistance-associated macrophage protein，Nramp5）基因調(diào)控水稻體內(nèi)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，該基因使植株具有吸附環(huán)境中Cd的能力并將其在籽粒中大量富集［62-63］。袁隆平團(tuán)隊(duì)通過(guò)利用基因編輯技術(shù)敲除該基因，發(fā)現(xiàn)突變體芽和根中的Cd濃度明顯降低，且對(duì)植物產(chǎn)量影響不顯著，最終在高鎘土壤中篩選鑒定出耐Cd水稻基因編輯材料［64］。

玉米ARGOS8（Aluminum-induced Protein Superfamily Pseudogene，ARGOS8）基因是植物乙烯反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，過(guò)表達(dá)ARGOS8的轉(zhuǎn)基因植物在干旱脅迫條件下對(duì)乙烯的敏感性減弱，產(chǎn)量提高［65］。Shi等［66］通過(guò)CRISRP系統(tǒng)對(duì)玉米進(jìn)行基因編輯，在該基因上游非編碼區(qū)插入玉米GOS2啟動(dòng)子以代替ARGOS8的天然啟動(dòng)子，產(chǎn)生了乙烯反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)因子ARGOS8的新變種，與野生型玉米相比，該材料對(duì)干旱的抗性增強(qiáng)。

MicroRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小約為19-22 nt，其主要在發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)［67］。2018年，朱健康團(tuán)隊(duì)利用其改良的基因編輯技術(shù)（Short Tandem Target Mimic，STTM）敲除水稻microRNA166，其中發(fā)現(xiàn)突變植株的葉片植株氣孔疏導(dǎo)能力降低，蒸騰速率降低，抗旱性增加，從而獲得 miRNA166低表達(dá)抗旱水稻新品系［68］。

3.6 抗病性

病害是影響我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，而現(xiàn)在主要的防治方法僅僅是提前消毒種子或在癥狀出現(xiàn)后噴施農(nóng)藥，但效果仍然不理想。但想要從根源上解決病害這一問(wèn)題，抗病作物品種選育至關(guān)重要。

水稻白葉枯病是亞洲和非洲的一種重要病害，病原體為水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo），該菌利用一組III型轉(zhuǎn)錄激活子效 應(yīng) 物（TALes）誘導(dǎo)宿主SWEET（Sugars Will Eventually be Exported Transporters，SWEET） 基 因表達(dá)，致使宿主易感該?。?9-70］。Zhou等［71］通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除OsSWEET13基因，提高水稻對(duì)該病的抗性，且證實(shí)了稻瘟病菌主要是通過(guò)提高宿主細(xì)胞對(duì)蔗糖的合成來(lái)侵染宿主。最近，楊兵課題組通過(guò)CRISPR系統(tǒng)突變SWEET11、SWEET13和SWEET14三個(gè)基因的啟動(dòng)子，并在突變體中不斷篩選鑒定得到對(duì)白葉枯病具有強(qiáng)大廣譜抗性的水稻株系［72］。

稻瘟病是世界上危害水稻最嚴(yán)重的病害之一，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）屬于半知菌亞門真菌，可引起大幅度減產(chǎn)。植物乙烯應(yīng)答因子（Plant ethylene responsive factors，ERF）是植物APETELA2/乙烯應(yīng)答因子（AP2/ERF）轉(zhuǎn)錄因子超家族的一個(gè)亞家族，它參與了多種脅迫耐受的調(diào)節(jié)，并參與了多種對(duì)非生物脅迫和生物脅迫的響應(yīng)［73-75］。趙開軍團(tuán)隊(duì)以稻瘟病感病品種空育131為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除OsERF922（Ethyleneresponsive transcription factor 2，ERF922），獲得的T2純合突變系在苗期和分蘗期對(duì)稻瘟病菌的抗性相比野生型都有顯著提高［76］。

水稻矮化?。≧ice tungro disease，RTD）是亞洲熱帶地區(qū)水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重制約因素，RTD是由水稻球形病毒（Rice tungro spherical virus，RTSV）與水稻桿狀病毒相互作用引起的，具有RTSV抗性的植株大部分也表現(xiàn)出RTD抗性［77］。自然RTSV抗性是由翻譯起始因子基因（The translation initiation factor 4 gamma，eIF4G）控制的隱性性狀，eIF4G蛋白中Y1059V1060V1061氨基酸殘基發(fā)生單核苷酸多態(tài)性（Single-nucleotide polymorphisms，SNPs）或缺失而獲得抗性［78］。利用該特性，Macovei等［78］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)RTSV敏感品種IR64中的eIF4G突變，該團(tuán)隊(duì)在溫室條件下篩選并鑒定到不含Cas9序列且具有RTSV抗性的相對(duì)高產(chǎn)植株。

小麥白粉病是一種世界性病害，小麥白粉病菌（Blumeria graminis）屬子囊菌亞門真菌。該病主要侵染作物的葉片與葉鞘，通過(guò)分生孢子或子囊孢子借氣流傳播到感病小麥葉片上。MLO（Mildewresistance locus，MLO）是大麥、小麥等作物中白粉病菌成功侵染所必需的基因［79］。該基因突變后，大麥表現(xiàn)出對(duì)白粉病菌的持久、廣譜抗性［80］。WANG等人通過(guò)TALEN與CRISPR/Cas9技術(shù)在六倍體小麥中編碼抗霉位點(diǎn)的蛋白的3個(gè)等位基因TaMLO-A1、TaMLO-B1、TaMLO-D1中引入靶向突變，得到對(duì)白粉病具有廣譜抗性的小麥［81］。

總之，CRISPR/Cas系統(tǒng)是作物分子育種的最新且最有效的途徑。表1總結(jié)了近年來(lái)CRISPR/Cas在作物育種上的應(yīng)用，其包含了目標(biāo)性狀靶基因、編輯類型和作物種類。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)在作物育種上的應(yīng)用

4 CRISPR/Cas局限性

如今CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)在真核生物當(dāng)中得到廣泛運(yùn)用，尤其是動(dòng)物當(dāng)中，其研究進(jìn)展十分迅速。植物基因編輯進(jìn)展相對(duì)落后的原因，除了動(dòng)植物本身之間的差異以外，CRISPR/Cas系統(tǒng)自身的缺陷也對(duì)編輯效率產(chǎn)生影響。

4.1 PAM序列的限制

目前被廣泛研究并應(yīng)用于植物編輯當(dāng)中的CRISPR核酸酶包括來(lái)自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9和來(lái)自毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium）的LbCpf1，SpCas9需要識(shí)別編輯靶位點(diǎn)的“NGG”PAM序列行使功能，LbCpf1則需要嚴(yán)格識(shí)別“TTTV”PAM位點(diǎn)發(fā)揮作用，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，這對(duì)于特定靶位點(diǎn)的選擇存在一定限制。因此，如何有效拓展CRISPR核酸酶PAM位點(diǎn)范圍，成為CRISPR系統(tǒng)在植物基因組編輯中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

日本橫濱市立大學(xué)Seiichi Toki團(tuán)隊(duì)通過(guò)定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，SpCas9的突變體SpCas9-NGv1（R1335A/ L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R /T1337R）可以在水稻和擬南芥基因組中以NG為PAM進(jìn)行有效突變［91］。

xCas9是最近發(fā)現(xiàn)的一種識(shí)別哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大多數(shù)PAM類型的Cas9變體，包括NG、GAA和GAT，xCas9已被證實(shí)可在水稻中進(jìn)行基因敲除以及堿基替換［56］。中國(guó)電子科技大學(xué)張勇團(tuán)隊(duì)和美國(guó)馬里蘭大學(xué)戚益平團(tuán)隊(duì)通過(guò)構(gòu)建來(lái)自弗朗西斯菌屬（Francisella novicida）的FnCpf1、LbCpf1核酸酶的RR及RVR突變體表達(dá)系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了以“CCCC”、“TYCV”、“TATG”為PAM位點(diǎn)的水稻基因組編輯，擴(kuò)大了Cpf1核酸酶在植物基因組編輯中的應(yīng)用范圍［92］。以上研究不僅有效地拓展了CRISPR的應(yīng)用，而且顯著提高了植物基因組的編輯范圍，但仍需進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，在擴(kuò)大編輯范圍的同時(shí)提高編輯效率。

4.2 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的限制

植物基因編輯效率的提高在一定程度上依賴于高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，目前常用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法及PEG轉(zhuǎn)化法（Polyethylene glycol，PEG），其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最成熟的轉(zhuǎn)化途徑，但由于宿主范圍的限制，只適用于部分植物物種和組織；基因槍轟擊法和PEG轉(zhuǎn)化法靶向受體材料類型廣泛，無(wú)宿主的限制，但基因槍轟擊法由于基因槍轟擊的隨機(jī)性，外源基因進(jìn)入宿主基因組的整合位點(diǎn)相對(duì)不固定，拷貝數(shù)往往較多，不利于外源基因在宿主植物的穩(wěn)定表達(dá)；PEG轉(zhuǎn)化涉及到植株再生問(wèn)題，目前僅有煙草等少數(shù)物種可以實(shí)現(xiàn)［93］。納米材料目前已經(jīng)廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，有研究表明納米顆?？梢赃\(yùn)送Cas9蛋白與sgRNA進(jìn)入細(xì)胞，并在30%的細(xì)胞中對(duì)目的基因進(jìn)行編輯［94］。CRISPR編輯技術(shù)結(jié)合納米顆粒在植物上的應(yīng)用將克服宿主范圍的限制，且適用于廣泛的植物物種和不同的組織。該技術(shù)的成功應(yīng)用將快速推進(jìn)作物的遺傳改良進(jìn)展。

4.3 DNA特異性識(shí)別的限制（脫靶）

除了擴(kuò)大基因組的編輯范圍，DNA的特異性識(shí)別也是需要攻破的又一難關(guān)。研究人員利用多種方法揭示了基于CRISPR的基因組編輯的DNA靶向特性，但卻沒(méi)有一種方法和算法能證明野生型Cas9蛋白與其同源的sgRNA存在靶外反應(yīng)。但仍存在很多案例，非靶位點(diǎn)的基因修改接近甚至超越靶位點(diǎn)修改的頻率［95］。

通過(guò)不斷地摸索，研究人員開發(fā)出以下幾種策略降低脫靶效率：其一為通過(guò)簡(jiǎn)單地截短sgRNA，使其與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)性少于20個(gè)核苷酸，結(jié)果是SpCas9的非目標(biāo)修飾可以減少幾個(gè)數(shù)量級(jí)［96-97］；其二是在有足夠的機(jī)會(huì)改變靶位點(diǎn)后降低其在細(xì)胞中的活性或壽命。例如，直接向細(xì)胞傳遞Cas9與sgRNA核糖核酸蛋白復(fù)合物（RNPs），該方法可保證Cas9蛋白的瞬時(shí)活性，且在一段時(shí)間后該蛋白會(huì)在細(xì)胞中降解［98］。此外，將Cas9核酸酶的兩個(gè)殘基的其中一個(gè)失活，改造其為nCas9，并分別設(shè)計(jì)兩個(gè)sgRNA，當(dāng)兩個(gè)nCas9同時(shí)與DNA鏈上的靶位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，DNA發(fā)生雙鏈斷裂，在一定程度上大大減少脫靶幾率［99］。

5 基因編輯作物的展望

傳統(tǒng)育種中利用的遺傳變異主要來(lái)自于自然過(guò)程、物理或化學(xué)的誘變，而這些變異概率低且突變位點(diǎn)不可預(yù)測(cè)，基因編輯技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)均能克服以上缺點(diǎn)，這對(duì)作物基因功能研究與遺傳育種具有重要的意義，但這兩種技術(shù)之間也有巨大的差異。轉(zhuǎn)基因技術(shù)一直在許多國(guó)家被稱為基因改造技術(shù)（Genetic modification），是將外源基因?qū)胩囟ㄗ魑锘蚪M當(dāng)中并使其表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)物的新型育種技術(shù)，這些基因可以來(lái)自同一物種內(nèi)部，也可以跨越物種邊界來(lái)生產(chǎn)新的作物。其核心在于具有表達(dá)優(yōu)良性狀能力的外源基因的導(dǎo)入，通過(guò)后代篩選保留該優(yōu)良性狀。與轉(zhuǎn)基因作物育種不同的是，基因編輯作物育種僅用于編輯作物內(nèi)源基因，且可以通過(guò)后代的雜交分離將導(dǎo)入的外源基因剝離，所以經(jīng)過(guò)基因編輯育種獲得的品種完全不含外源基因。

未來(lái)基因編輯育種技術(shù)在作物改良育種方面的發(fā)展大概有以下幾種思路：第一，許多作物的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，而大多數(shù)已測(cè)序的基因功能仍未知。通過(guò)基因敲除創(chuàng)建全基因組水平的大規(guī)模突變體文庫(kù)是該工具未來(lái)應(yīng)用的必然趨勢(shì)，此舉對(duì)于功能基因組研究與作物改良具有重要意義；第二，作物的優(yōu)良性狀往往依賴復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，而除了敲除外該工具還可以通過(guò)調(diào)控基因的上下游序列或轉(zhuǎn)錄因子致使某些基因表達(dá)或被抑制。甚至該工具可直接調(diào)控RNA，在不影響遺傳的情況下直接在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控，這可以直接用來(lái)評(píng)估調(diào)控區(qū)域與表型的關(guān)系進(jìn)而促進(jìn)作物育種；第三點(diǎn)是優(yōu)秀的品系往往需要集各種優(yōu)良性狀于一身，這需要多個(gè)控制優(yōu)良性狀的基因組同時(shí)表達(dá)，因此能夠同時(shí)操控并調(diào)控多個(gè)基因的基因編輯技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值［100］。

利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行作物改良育種的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)顯而易見，但在能否市場(chǎng)化的問(wèn)題上還存在較大爭(zhēng)議。到目前為止，歐盟已經(jīng)批準(zhǔn)了大約118種轉(zhuǎn)基因生物，但大多數(shù)轉(zhuǎn)基因生物是用來(lái)喂養(yǎng)動(dòng)物的，只有極少數(shù)是供人類直接食用，歐洲幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)基因食品的市場(chǎng)，基因編輯作物被一并認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)物并按照該技術(shù)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)管［101］。與歐盟的態(tài)度不同，2016年賓夕法尼亞大學(xué)利用基因編輯培育的抗褐變蘑菇，在美國(guó)并未受到監(jiān)管［102］。此舉標(biāo)志著美政府對(duì)該技術(shù)的緩和態(tài)度，而在2018年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部正式發(fā)布聲明，表示不會(huì)對(duì)一些新育種技術(shù)的作物進(jìn)行監(jiān)管，而其中就包括基因編輯技術(shù)。

由于各國(guó)對(duì)于基因編輯及其產(chǎn)物定義并不統(tǒng)一，因此各國(guó)的管理方法與管理現(xiàn)狀也不盡相同。而對(duì)于全世界來(lái)說(shuō)，這種新穎的生物技術(shù)所帶來(lái)的意義十分深遠(yuǎn)，其不光在農(nóng)業(yè)與醫(yī)學(xué)方面帶來(lái)全新的局面，還會(huì)對(duì)社會(huì)的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易方面造成影響。只是現(xiàn)在這種不穩(wěn)定的局面還無(wú)法讓其飛速拓展開來(lái)，但隨著基礎(chǔ)研究的加深與其他學(xué)科的發(fā)展，該技術(shù)定將獲得大眾接受并廣泛應(yīng)用。中國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，其糧食作物產(chǎn)量近年來(lái)屢創(chuàng)新高，但這些產(chǎn)量的背后是除草劑與化肥的不合理使用造成的環(huán)境破壞問(wèn)題與無(wú)法應(yīng)對(duì)日漸惡劣的環(huán)境而逐漸枯竭的優(yōu)良品種?；蚓庉嫾夹g(shù)對(duì)于中國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展以及提高產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新能力具有重大意義。相信在不久的將來(lái)，我國(guó)將具備該技術(shù)的成熟體系，并將其產(chǎn)業(yè)化以服務(wù)農(nóng)業(yè)，在新的農(nóng)業(yè)革命當(dāng)中領(lǐng)先于世界。