夏興莉，廖界仁，任太鈺，馬媛春，王玉花，房婉萍，朱旭君

(南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種有天然活性的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布于動物和植物體內(nèi)，有多種生理功能[1-2]。富含GABA的茶樹〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕葉片有降血壓和減少細胞凋亡等生物活性[3-5]，因而，提高茶葉中GABA含量可提升茶葉的保健功效。目前，茶葉GABA的富集主要采用厭氧處理，邢志強[6]采用多種脅迫方法研究了茶葉中GABA的富集效應，認為水浸漬、真空、紫外線和冷凍處理富集GABA的效果均低于各類厭氧處理；然而，雖然厭氧處理富集GABA效果較好，但會導致茶葉的色澤與性質(zhì)發(fā)生變化，對茶葉品質(zhì)有較大影響[7-8]，因而，探究既能富集茶葉中GABA又對茶葉品質(zhì)影響較小的處理技術(shù)十分必要。

目前，低溫處理富集GABA在桑(MorusalbaLinn.)[2]和馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)[9]等植物中已得到驗證。低溫處理在茶葉運輸和貯藏等環(huán)節(jié)有重要作用，可延緩茶葉品質(zhì)劣變。為明確低溫處理對茶葉中GABA富集的影響，探討GABA含量與茶葉品質(zhì)的關(guān)系，作者以茶樹品種‘龍井43’(Camelliasinensis‘Longjing 43’)為研究對象，測定4 ℃低溫處理不同時間后茶樹葉片中GABA和其他活性成分含量的變化，以期為茶葉中GABA含量富集技術(shù)及品質(zhì)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試茶樹品種‘龍井43’于2018年4月28日采自南京中山陵園管理局中山陵茶廠試驗茶園(東溝一區(qū)地)，采摘標準為一芽一葉至一芽二葉，共采集葉片約200 g。將鮮葉置于4 ℃下分別處理0(對照)、3、6和9 h，微波(75 W)殺青、揉捻后，于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，冷卻后磨成粉，待用。

主要儀器：UH5300雙光束分光光度計(日本Hitachi公司)、L-8900氨基酸全自動分析儀(日立高新技術(shù)公司)、Agilent Infinity 1290超高壓液相色譜儀(美國Agilent公司)。標準品：GABA(純度大于等于99.90%)、咖啡堿(純度99.90%)以及兒茶素類(包括沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯，純度99.99%)標準品均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GABA標準品測定和標準曲線繪制 用超純水將1 mg·mL-1GABA標準品母液逐級稀釋至0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μg·mL-1。各取200 μL樣品，加入100 μL OPA衍生試劑〔0.05 mol·L-1硼酸緩沖液(pH 9.5)50 mL和0.2 mol·L-1NaOH溶液23 mL的混合溶液〕反應1 min，加入0.1 mol·L-1KH2PO4溶液200 μL，即為對照品溶液。按照下述色譜條件對標準品溶液進行測定。

色譜條件： ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動相A為20 mmol·L-1乙酸，流動相B為V(20 mmol·L-1乙酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2的混合液，0～4 min體積分數(shù)65%流動相A，4～8 min體積分數(shù)60%流動相A，8～13 min體積分數(shù)50%流動相A，再運行3 min；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃，激發(fā)光350 nm、發(fā)射光450 nm；進樣量2 μL。以峰面積為縱坐標、GABA標準品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，擬合方程為y=331.113x-18.078(R2=0.998)，線性范圍0.005～2.500 μg·mL-1。

1.2.2 樣品中GABA提取和測定 稱取0.5 g樣品粉末，加入25 mL蒸餾水，于85 ℃水浴提取2 h；取5 mL提取液，室溫下12 000 r·min-1離心10 min；取上清液3 mL，加入600 μL三氯甲烷，室溫下12 000 r·min-1離心10 min；取上清液800 μL，用0.2 μm聚四氟乙烯濾膜過濾，得到樣品溶液。按上述GABA標準品的測定方法和色譜條件測定樣品溶液中的GABA含量。按照峰面積歸一化法計算樣品中GABA含量。

1.2.3 樣品中其他成分含量測定 根據(jù)GB/T 8305—2013中的方法測定水浸出物含量，根據(jù)GB/T 8314—2013中的方法測定游離氨基酸含量，根據(jù)GB/T 8313—2018中的方法測定咖啡堿、茶多酚和兒茶素類含量。

2 結(jié)果和分析

在4 ℃低溫處理0(對照)、3、6和9 h后，茶樹葉片中GABA含量的變化見圖1，茶樹葉片中水浸出物、游離氨基酸、咖啡堿、茶多酚和兒茶素類含量變化見表1。

不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

表1 4 ℃低溫處理不同時間對茶樹品種‘龍井43’葉片中主要活性成分含量的影響

由圖1可見：隨低溫處理時間的延長，茶樹葉片中的GABA含量呈先升高后降低的變化趨勢，并在處理6 h后達到最高(0.98 mg·g-1)，在處理9 h后降至最低(0.80 mg·g-1)，且二者與對照(處理0 h)和其他處理時間均存在顯著(P<0.05)差異。

由表1可見：經(jīng)4 ℃低溫處理不同時間后，茶樹葉片中的水浸出物、游離氨基酸、茶多酚和兒茶素類含量存在一定差異，而咖啡堿含量無顯著差異。其中，處理3～9 h后水浸出物和游離氨基酸的含量均顯著高于對照，處理9 h后茶多酚和兒茶素類含量均顯著低于對照，但其他處理時間均與對照無顯著差異。

由表1還可見：經(jīng)4 ℃低溫處理不同時間后，沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素含量均無顯著變化，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯和兒茶素沒食子酸酯含量在處理9 h后顯著低于對照，但其他處理時間均與對照無顯著差異。

總體上看，4 ℃低溫處理3和6 h后茶樹葉片中的水浸出物和游離氨基酸含量顯著高于對照，咖啡堿、茶多酚和兒茶素類含量與對照無顯著差異。

3 討論和結(jié)論

已有研究結(jié)果表明：在低溫環(huán)境下菠菜(SpinaciaoleraceaLinn.)[10]、胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)[11]和荔枝(LitchichinensisSonn.)[12]葉中的GABA含量均不同程度升高；而本研究中，4 ℃低溫處理6 h后，茶樹葉片中GABA含量顯著(P<0.05)高于對照(處理0 h)，說明低溫處理可富集茶樹葉片中GABA。這是由于低溫處理可加速蛋白質(zhì)分解，活化GABA合成酶谷氨酸脫羧酶(GAD)催化谷氨酸合成GABA，同時在低溫條件下GABA代謝酶(GABA-T)的活性降低，阻礙了GABA代謝，使GABA得到富集[7，13]。

盡管厭氧處理具有明顯的GABA富集效應，但長時間厭氧處理易造成茶葉品質(zhì)和口感變化[1，7-8]。經(jīng)4 ℃低溫處理3和6 h后，茶樹葉片中的水浸出物和游離氨基酸含量顯著增加，而咖啡堿含量、茶多酚和兒茶素類含量無顯著變化，其中酯型兒茶素類成分(苦澀味成分)含量一定程度降低，表明4 ℃低溫處理3～6 h既可保持茶葉品質(zhì)，又能富集GABA。

由于本實驗設(shè)計較為粗放，涉及的茶葉品種單一，因而，后續(xù)將細化低溫處理條件(包括處理溫度和處理時間)，擴大茶樹品種范圍，針對不同茶樹品種篩選出各自適宜的低溫處理條件，以期為茶葉中GABA富集技術(shù)的開發(fā)應用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。