杜 璐，姜曉燕，丁庫克

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所放射生態(tài)研究室，北京 100088)

目前宮頸癌依舊是威脅我國女性生命健康的主要公共衛(wèi)生問題之一，是女性常見的惡性腫瘤，其對女性生命健康的危害僅次于乳腺癌[1-2]。放射治療是臨床上治療宮頸癌的重要手段之一，但在治療過程中存在輻射不敏感，所以在放療中輻射敏感性的研究成了熱點問題。近年來研究者們試圖尋找輻射敏感性基因作為宮頸癌治療的靶點，以提高放療效果[3]。人類腫瘤的發(fā)生與特定細胞周期蛋白水平的改變有一定的相關(guān)性[4]，本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)IER5 為宮頸癌放療敏感基因，與細胞周期密切相關(guān)。該基因的過表達具有抑癌基因的功能，能抑制宮頸癌和肝癌細胞增殖。在輻射刺激下IER5表達量升高，并與CDC25B表達存在負相關(guān)關(guān)系，通過對CDC25B 基因啟動子報告基因載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄活性分析發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子Yβ 亞基(nuclear transcription factor Y subunit beta，NF-YB)是CDC25B的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[5-7]。

NF-YB 是核轉(zhuǎn)錄因子Y(nuclear transcription factor Y，NF-Y)的一個亞基，基因定位于染色體12q22-q23。NF-Y是一種三聚體的CCAAT結(jié)合因子，能夠識別并結(jié)合CCAAT 序列，刺激基因的轉(zhuǎn)錄，并且CCAAT 序列在G2/M 期調(diào)控基因的啟動子中大量存在[8-9]。通過控制細胞周期進展中所需基因的表達[10-11]和各種基因的轉(zhuǎn)錄起始，參與細胞增殖的調(diào)節(jié)[12]，特別是在G2/M期基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有基本功能?；蛐酒湍孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應數(shù)據(jù)表明，NF-YB敲除不僅使G2/M 期基因的表達受到抑制，并且在沒有DNA損傷的情況下，能激活p53 及其促凋亡的靶基因[13]。當NF-YB 基因沉默時對細胞G2/M 期產(chǎn)生嚴重影響，但基本不干擾細胞S 期的進展[11，14]。Nakamura 等[15]在研究急性髓細胞白血病的發(fā)生發(fā)展時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過TMPP(一種抗白血病藥物)處理后通過介導NF-YB 和p300的釋放，引起細胞周期G2/M期阻滯并且抑制白血病細胞增殖。Iyer 等[16]發(fā)現(xiàn)NF-YB 在脊椎動物精原干細胞中可促進細胞的自我更新和增殖，凋亡生殖細胞增加。Fang等[17]在結(jié)直腸癌實驗中證明NF-YB敲降后會減弱細胞的耐藥性。目前NF-YB基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用還未見相關(guān)的研究，為了探究NF-YB基因在宮頸癌中的作用，我們選取宮頸癌細胞系HeLa作為模式細胞，針對HeLa 細胞中的NF-YB 基因，設計shRNA 引物序列，利用RNA 干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的NF-YB 基因敲降HeLa 細胞系，為進一步研究該基因在宮頸癌中相關(guān)的機制及功能提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa 細胞及人胚胎腎293T 細胞由本實驗室保存；DMEM 培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司；胰酶，胎牛血清，青鏈霉素混合液雙抗購于BI 公司；DNA 內(nèi)切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)，DNA 連接酶，DNA marker 購于MBI Fermentas 公司；轉(zhuǎn)染試劑RNAi-Mate，載體H1/GFP-Puro、包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G 購于蘇州吉瑪基因有限公司；鼠源anti-βactin 抗體購于Proteintech Group 公司；鼠源anti-NFYB 抗體購于美國Santa Cruz 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒MonScriptTMRTⅢAll-in-One Mix with dsDNase 購于莫納生物科技有限公司；2×RealStar Green Power Mixture with ROXⅡ試劑盒購于北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)293T、HeLa 細胞均用含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察其生長狀態(tài)，當匯合度達90%時進行傳代。

1.2.2 構(gòu)建質(zhì)粒利用Sigma 公司網(wǎng)站(http://www.sigmaaldrich.com/)查詢目的基因的shRNA 引物序列，選擇基因敲低效率較高的序列插入酶切位點，在序列前后加入幾個保護堿基提高酶切活性，Loop結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA 以避免形成終止信號。shRNA 引物送蘇州吉瑪基因有限公司合成。將寡聚核苷酸鏈退火合成相應的雙鏈DNA，經(jīng)與BamHⅠ與EcoRⅠ雙酶切線性化的慢病毒載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，經(jīng)氨芐抗性篩選，提取H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB 質(zhì)粒(按照質(zhì)粒提取試劑盒步驟操作)送蘇州吉瑪基因有限公司測序。陽性重組質(zhì)粒分別命名H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YBsh1、H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB-sh2、H1/GFPPuro-shRNA-NF-YB-sh3，空白對照質(zhì)粒命名為H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB-control(下文中分別簡稱SH1、SH2、SH3、CON)。靶序列及引物序列見表1。

表1 靶序列及引物序列

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及病毒收集將293T 細胞培養(yǎng)12 h左右，匯合度達到60%時進行轉(zhuǎn)染。取無菌EP管，加入無血清DMEM、按比例加入H1/GFP-Puro-shRNANF-YB 穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSVG)混勻。取另一支無菌EP管，加入適量無血清DMEM和1/5 的RNAi-Mate 混勻，室溫放置5 min 后將兩個EP 管中的混合液混合并吹打均勻，室溫放置20～25 min。將混合液逐滴加入培養(yǎng)皿中，6 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)72 h。收集培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液離心、過濾。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞感染及篩選對狀態(tài)良好的HeLa 細胞進行感染，加入適量濃度病毒液的同時加入5 μg/mL 聚凝胺溶液，以提高感染效率。6～8 h 時觀察細胞狀態(tài)，24 h后換成新鮮培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)48 h后加入濃度為2 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行細胞篩選，觀察細胞狀態(tài)及細胞死亡數(shù)量，然后按梯度增加嘌呤霉素的濃度至實驗組細胞無明顯死亡且空白對照組細胞全部死亡，最后加入濃度為10 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)1周后即篩選出shRNA-NF-YB-HeLa穩(wěn)定細胞系。

1.2.5 RNA 提取和實時熒光定量PCR 檢測收集細胞，加入500 μL 的Trizol，在冰上靜置待其充分裂解，加入1/5 體積的三氯甲烷振蕩混勻離心，吸上層水相至RNase free的EP管中加入等量的異丙醇混勻離心，棄上清收集RNA沉淀，用70%的乙醇清洗后加入適量DEPC 水溶解，最后用酶標儀紫外分光光度法定量RNA。取等量RNA 用MonScriptTMRT Ⅲ All-in-One Mix with dsDNase 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR 使用2×RealStar Green Power Mixture with ROXⅡ試劑盒。實時熒光定量PCR使用的基因引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR使用的基因引物序列

1.2.6 Western blot將篩選后的HeLa 細胞加入1×SDS上樣緩沖液，混勻后99.9 ℃金屬浴15 min，使之變性。收集的蛋白樣品使用10%的SDS-PAGE 電泳分離，每孔上樣10 μL，分離條件為80 及120 V。硝酸纖維素膜250 mA 恒流轉(zhuǎn)膜，使用封閉緩沖液封閉轉(zhuǎn)印膜1 h，TBST 洗膜后按照marker 指示切下目的條帶。加入NF-YB一抗、β-anctin一抗4 ℃搖床孵育過夜。TBST 清洗后加入山羊抗小鼠二抗室溫搖床孵育1 h。清洗后加ECL 顯影液進行化學發(fā)光檢測，暗室壓片，顯影，洗片，掃描片子后用ImageJ進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

各組數(shù)據(jù)值用xˉ±s 表示，所有的數(shù)據(jù)處理用GraphPad Prism 軟件，組間數(shù)據(jù)進行多重t 檢驗。以α=0.05為檢測水準。

2 結(jié) 果

2.1 H1-GFP/puro-shRNA-NF-YB質(zhì)粒的構(gòu)建

將提取所得質(zhì)粒進行測序。結(jié)果如圖1。測序結(jié)果表明插入的目的片段與設計目的靶基因序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有突變、插入異常等異常情況存在。表明已成功構(gòu)建H1-GFP/puro-shRNA-NF-YB質(zhì)粒。

圖1 靶序列測序結(jié)果

2.2 感染效率的檢測

將感染后的細胞正常培養(yǎng)72 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達。觀察結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，90%以上的細胞中均有綠色熒光的表達，提示細胞被高效率轉(zhuǎn)染。

2.3 敲低效率的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

收集篩選后的細胞提取RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用實時熒光定量PCR檢測NF-YB mRNA的表達。用熒光PCR 儀QuantStudio 3(Thermo Scientific)獲得每個樣品中的內(nèi)參β-actin和目的基因NF-YB的CT值，計算2-ΔΔCT值為基因的相對表達量。結(jié)果顯示SH1和SH3轉(zhuǎn)染組相比空白對照組在mRNA 水平表達量明顯減少(P＜0.01)，提示SH1和SH3的穩(wěn)定敲降細胞株構(gòu)建成功(圖3)。

2.4 敲低效率的Western blot檢測結(jié)果

取篩選后的細胞加入1×SDS上樣緩沖液金屬浴變性后，通過Western blot 在蛋白水平對NF-YB 的表達進行檢測，條帶用ImageJ 計算其灰度值。結(jié)果顯示SH1 和SH3 轉(zhuǎn)染組相比空白對照組在蛋白水平表達明顯減少(P＜0.01)，提示SH1 和SH3 顯著降低了NF-YB的表達(圖4)。

3 討 論

RNA 干擾技術(shù)被Jorgensen R 發(fā)現(xiàn)報道，他在牽牛花中導入色素合成基因后，不僅想要的色素沒有合成，插入的基因也沒有表達，這種現(xiàn)象被稱為共抑制[18]。直到Fire 等[19]研究結(jié)果表明在導入了雙鏈RNA后會導致目的基因的特異性沉默，才將其命名為RNA干擾。2002年RNA干擾技術(shù)被Science和Nature評為重大科技成果之一，它具有高效性、高特異性等特點[20]。短發(fā)夾RNA(shRNA)，包含一個Loop 結(jié)構(gòu)，可加工成siRNA，也可通過與目標mRNA 互補結(jié)合序列特異性地實現(xiàn)靶mRNA 降解。使用細菌或病毒載體，被導入靶細胞的細胞核內(nèi)，在某些情況下，載體可以穩(wěn)定地整合到基因組中。

圖2 熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達

圖3 qPCR檢測結(jié)果

圖4 Western blot檢測結(jié)果

宮頸癌是一種最常見的婦科惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率與病死率已經(jīng)上升至女性生殖道惡性腫瘤首位，嚴重威脅著女性的生命健康[21-22]?，F(xiàn)已證明宮頸癌的發(fā)生是體內(nèi)外等多方面因素共同作用的結(jié)果。體細胞中基因結(jié)構(gòu)及拷貝數(shù)量的改變均能夠引起基因功能的變化，導致細胞正常增殖凋亡過程紊亂，甚至發(fā)生癌變。經(jīng)過課題組前期研究證實IER5為宮頸癌的輻射敏感性基因，在輻射刺激時IER5與CDC25B呈負相關(guān)關(guān)系，經(jīng)過基因啟動子報告表明NF-YB 為CDC25B的調(diào)控因子[5-7]。研究者們在多個試驗中發(fā)現(xiàn)NF-YB影響著細胞周期的發(fā)展[11，14-17]，并且在沒有DNA 損傷的情況下，NF-YB 的沉默能激活p53 及其促凋亡的靶基因[13]。

本研究設計出特異性敲降NF-YB 的有效序列后，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了H1-GFP/puro-shRNA-NFYB質(zhì)粒，經(jīng)過測序證實插入序列與設計序列一致，表明成功構(gòu)建了H1-GFP/puro-shRNA-NF-YB 質(zhì)粒。并成功轉(zhuǎn)染至細胞中，觀察細胞中GFP的表達表明轉(zhuǎn)染效率高達90%。收集篩選后的細胞應用Western blot和實時熒光定量PCR分別在蛋白質(zhì)水平和RNA水平證明構(gòu)建的3 個質(zhì)粒中有2 個都不同程度的抑制了NFYB 的表達，敲降效率達60%以上，以上實驗結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定干擾NF-YB 的HeLa 細胞系并且效果差異顯著。為后續(xù)研究NF-YB 對HeLa 細胞周期及其他功能的影響奠定了良好的基礎。