張春雷，楊 琦，訾曉淵，孫穎浩

(1．海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院泌尿外科，上海 200433；2．海軍軍醫(yī)大學細胞生物教研室，上海 200433；3．聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院泌尿外科，甘肅 蘭州 730050)

環(huán)狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一種通過反向剪接機制由線性RNA 前體的5′端和3′端共價相接形成具有特殊環(huán)狀結構的非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)，成為繼長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)和microRNAs(miRNAs)之后，另一大類ncRNAs 家族成員，在許多生物過程中發(fā)揮調控作用，如細胞增殖、細胞衰老和細胞凋亡等。早在20世紀70年代，circRNAs首先在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，但由于其表達豐度較低，被認為是錯誤翻譯造成的垃圾序列。近年來，隨著高通量RNA 測序技術和生物信息學技術的發(fā)展，已經發(fā)現(xiàn)了數以萬計的circRNAs，其功能被逐漸識別，實驗證明一些circRNAs的表達水平顯著高于同源基因的線性轉錄本的表達水平[1]。CircRNAs在哺乳動物細胞中具有豐富的表達量和進化上具有較高的保守性，在各種生理和病理過程中對基因表達的調控起著重要作用。CircRNAS 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演重要角色，多項報道已經先后證明了circRNAs-miRNAsmRNA信號通路參與了各種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。為此，本文就circRNAs 的生物學特性、形成機制、功能以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的最新進展進行綜述。

1 circRNAs的生物學特性及形成機制

CircRNAs具有多種生物學特性[2]。首先，circRNAs普遍存在于生物界，通過對轉錄組測序結果中的反向剪接序列分析得知，circRNAs 廣泛表達于原核生物和真核生物中，包括病毒、細菌、真菌、動物等。其次，circRNAs具有高度穩(wěn)定性，由于它們對RNA 核酸外切酶或RNA 酶R 的抗性，circRNAs 比線性RNA 分子更穩(wěn)定，這可能導致circRNAs 在較為穩(wěn)定的細胞中富集，具有較高的表達豐度，如在神經元細胞中高表達。CircRNAs 在物種進化上還具有高度保守性，尤其在哺乳動物的腦組織中的表達。不同物種之間的同源性研究表明，人類和小鼠的circRNAs 中高達20%是直系同源的[3]。另外，circRNAs具有較好的組織特異性且較多的富集于外泌體中。

CircRNAs 可由外顯子、內含子、基因間序列、反義鏈序列、ncRNAs 等形成，分為全外顯子型circRNAs、內含子型環(huán)狀RNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)、外顯子-內含子型環(huán)狀 RNA(exon-intron-circRNAs， EIciRNAs) 和 其 他 類 型circRNAs。目前，全外顯子型circRNAs 形成機制的研究較多，經典的形成機制是由RNA 的5′端及3′端通過共價結合反向剪接形成，另一個比較常見的機制是RNA 序列通過外顯子跳讀形式產生一個包含外顯子的套索結構，套索內的剪接機制通過移除內含子形成circRNAs。CiRNAs 主要是由于在正常剪接過程中形成的內含子套索未能脫分支化造成的，據報道，在內含子序列內，5′剪接位點附近7 nt GU富集片段和分支點附近11 nt 富含C 的基序片段可以促進ciRNAs 的形成[4]。在circRNAs 環(huán)化過程中，多種因素參與該過程的調節(jié)[5]。例如，circRNAs形成時內含子長度可能起到關鍵作用，反向剪接位點側翼序列往往比那些非環(huán)化的剪接位點側翼序列長，這可能是因為序列較長的內含子間可以形成更多的RNA-RNA 相互作用，促進內嵌外顯子的環(huán)化。外顯子長度也可能是一個因素，單環(huán)外顯子的長度往往是那些非環(huán)化外顯子長度的3 倍左右，序列較長的外顯子可能在空間上優(yōu)先選擇在剪接位點進行3′-5′方式剪接。此外，基因序列的分布也很重要，易形成環(huán)化的RNA側翼通常包含反向互補堿基序列，比如Alu序列，這樣的序列可以形成雙鏈RNA 使得進行剪接的序列相互靠近，促進反向剪接的形成，即使僅有30～40 nt 的反向重復序列也能夠起到類似的作用。除了以上因素，RNA 結合蛋白(RNA binding protein，RBP)也可以調節(jié)circRNAs 的形成，RBP 如Quaking(QKI)和Muscleblind(MBL/MBNL1)可與反式剪接位點側翼內含子結合并可能驅動環(huán)化的發(fā)生。另外，具有較高轉錄效率的親本基因生成的circRNAs 也相對較多，說明轉錄效率也是調節(jié)circRNAs形成的因素之一。

2 circRNAs的功能

2.1 miRNAs海綿吸附功能

研究結果表明circRNAs上具有miRNAs的結合位點，通過吸附miRNAs起到miRNAs海綿的作用[6]，目前研究的circRNAs作用機制主要集中在這一功能。CircRNAs 可以結合特定的miRNAs，吸附它們并抑制其功能，這種現(xiàn)象稱為競爭性內源RNA 假說。早期發(fā)現(xiàn)影響斑馬魚中腦發(fā)育的circRNA CiRS-7(也稱CDR1as)具有70 多個miR-7 的結合位點，同時還可以結合RNA 誘導沉默復合物Argonaute(AGO)蛋白來調節(jié)miRNAs 的功能。CDR1as 也可以結合miR-671，后者可以誘導AGO 引起CDR1as自身裂解，起到釋放miR-7的作用。然而，像CDR1as這種包含某一特定miRNA 多個結合位點的circRNAs 并不多，比如circHIPK3 只含有兩個miR-124 結合位點，但仍保留了調節(jié)這種miRNA 的能力，說明對于circRNAs 來說，具有某一特定miRNA多個結合位點的特性可能不是高效調節(jié)miRNAs的先決條件，circRNAs 可能通過同時調節(jié)多個具有協(xié)同作用的miRNAs而發(fā)揮作用，比如circHIPK3含有9個具有生長抑制作用的不同miRNAs的結合位點。

2.2 影響基因的轉錄及剪接功能

CircRNAs可以調控基因的轉錄[7]，這些circRNAs主要分布在細胞核中。研究者發(fā)現(xiàn)EIciRNAs 能夠與RNA 聚合酶II 結合，影響其轉錄活性。比如EIciEIF3J 能夠與核內小核糖體核蛋白U1 及EIF3J 的啟動子相互作用，進而強化EIF3J 的轉錄。CircRNAs也能夠影響核酸的剪接，circMBL是由MBL的第2個外顯子前體mRNA 環(huán)化形成，它的側翼內含子序列能夠與MBL 結合，既可以直接影響MBL 的活性，又可以與經典剪接方式競爭，調節(jié)MBL前體mRNA的剪接。

2.3 調節(jié)翻譯及與蛋白質結合

如果circRNAs 環(huán)化序列包含其親本基因的翻譯起始密碼子，可能會影響同源基因線性轉錄本的翻譯，比如circHIPK3和circDMD 等可以調節(jié)親本基因對應蛋白質的表達[7]。此外，circRNAs 能夠與蛋白質結合，通過抑制蛋白質功能而發(fā)揮作用[8]。RNA結合蛋白能夠與circRNAs特異序列發(fā)生結合，導致與之相互作用的mRNA的相關功能如剪接、核輸出和亞細胞定位均會受到影響。例如circ-Foxo3在腫瘤細胞中特異表達并影響細胞周期，它能夠結合CDK2 和p21 形成RNA-蛋白復合物，破壞CDK2與細胞周期素A和細胞周期素E之間的相互作用，進而影響細胞周期。Circ-Foxo3 還可以和ID1，E2F1，F(xiàn)AK 以及HIF-1α等蛋白相互作用，抑制這些蛋白發(fā)揮功能，促進心肌的衰老。PABPN1 翻譯與HuR 相關，其對應的環(huán)狀RNA circPABPN1與HuR 的相互作用降低了PABPN1轉錄本的翻譯效率，為circRNAs 既可以與蛋白質結合，又可以影響翻譯提供有力證據。

2.4 翻譯蛋白

隨著研究的不斷深入，circRNAs 的編碼功能逐漸被發(fā)現(xiàn)[9]。circRNAs存在m6A修飾，METTL3/METTL14-WTAP蛋白復合物能夠對circRNAs 進行m6A 修飾，經過修飾的circRNAs先后募集YTHDF3 和eIF4G2，從而啟動蛋白翻譯過程。在膠質瘤中，circ-FBXW7可翻譯蛋白FBXW7-185aa，這種蛋白與親本基因編碼蛋白發(fā)揮協(xié)同作用，共同調控c-Myc 的穩(wěn)定性，抑制惡性膠質瘤的進展。Circ-ZNF609可直接翻譯蛋白，這種蛋白與肌肉形成有關。Pan 等[10]一項最新報道證明，結腸癌中circFNDC3B 編碼蛋白可以抑制Snail1 表達并抑制EMT 和腫瘤進展。

3 circRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

3.1 circRNAs與消化系統(tǒng)惡性腫瘤

多項研究結果表明circRNAs 與消化系統(tǒng)的腫瘤進展密切相關，包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、胃癌(gastric cancer，GC)、口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、食道鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)、結直腸癌(colorectal cancer，CRC)、胰腺導管腺癌等。CiRS-7 在HCC 組織中含量較高，通過靶向作用于miR-7來促進CCNE1和PIK3CD表達，增強HCC細胞增殖和侵襲能力[11]。曹雪濤院士團隊發(fā)現(xiàn)circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135)在HCC 組織中顯著下調，通過吸附miR-9 促進p21 表達進而抑制HCC 進展[12]。CircPVT1 在GC 組織中表達量高于癌旁組織，進一步實驗表明其可通過吸附miR-125 家族成員以促進細胞增殖[13]。Li 等[14]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000096 在GC 組織中顯著下調，其可通過抑制CCND1、CDK6、MM9-2 和MMP-9 表達來抑制GC 細胞的增殖和轉移。Zhang 等[15]實驗證據表明circLARP4在GC組織中下調并通過降低miR-424 靶基因LATS1表達來促進細胞生長和腫瘤轉移。CircRNAs在結直腸癌中的研究較多，Huang等[16]發(fā)現(xiàn)在CRC組織中cir-ITCH 表達下調后抑制ITCH表達，激活Wnt/β-catenin途徑的促腫瘤作用，cir-ITCH 表達上調后細胞增殖能力降低，在CRC 中通過調節(jié)ITCH 表達發(fā)揮抗腫瘤作用。另有研究報道，hsa_circ_001569 作為CRC 的細胞增殖和侵襲的正調控因子，通 過miR-145 靶 向 作 用 于E2F5、BAG4和FMNL2[17]，hsa_circ_0020397 通過吸附miR-138 促進TERT 和PD-L1 表達從而調節(jié)CRC 細胞生物學功能[18]。一項最新研究表明，circLONP2 通過調節(jié)miR-17，在CRC 的轉移過程中發(fā)揮重要作用[19]。在OSCC 的研究中，Chen 等[20]發(fā)現(xiàn)與對照癌旁組織相比，circRNA_100290在癌組織中顯著上調，通過吸附miR-29b家族成員而增加CDK6 表達，促進腫瘤進展，表明circRNA_100290 可能是OSCC 治療中的潛在靶標。在ESCC 的研究中，Li等[21]發(fā)現(xiàn)cir-ITCH在腫瘤組織中表達量相對較低，與結直腸癌中的作用機制類似，下調的cir-ITCH 可能通過miR-7、miR-17和miR-214等途徑降低ITCH的表達水平，激活Wnt/βcatenin 信號通路，因而cir-ITCH 在ESCC 中起到腫瘤抑制作用。另有研究報道表明，circFOXK2通過作為miR-942海綿和與RBP結合共同促進胰腺導管腺癌的生長和轉移[22]。

3.2 circRNAs與肺癌

隨著對circRNAs 研究的關注，逐漸發(fā)現(xiàn)circRNAs 在肺癌的發(fā)展中可能也存在重要作用[23]。Cir-ITCH在肺癌中作為一個抑癌因素，充當miR-7和miR-214的海綿，調節(jié)其線性轉錄本ITCH 表達，cir-ITCH 的下調使Wnt/β-catenin 通路激活，啟動腫瘤進展機制。研究結果表明hsa_circ_0000064在肺癌組織中上調并促進細胞增殖和轉移。在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的研究中，circ_0013958在癌組織中表達上調，通過吸附miR-134 上調致癌基因CCND1，促進腫瘤進展，circ_0013958具有作為早期生物標志物用來檢測以及篩查肺癌的潛能。Circ_100876 在NSCLC 組織中顯著高表達，其表達水平與淋巴結轉移和NSCLC腫瘤分期存在相關性。

3.3 circRNAs與泌尿系惡性腫瘤

越來越多的研究驗證了circRNAs 在泌尿系腫瘤的診斷和治療中的價值。在膀胱癌研究中，Huang 等[24]發(fā)現(xiàn)circRNA MYLK/miRNA-29a-3p/DNMT3B/VEGFA/ITGB1 信號通路可能與膀胱癌有關，另一項研究結果表明circHIPK3通過靶向作用于miR-558并調節(jié)乙酰肝素酶表達量進而抑制膀胱癌的生長和轉移[25]。在腎癌的研究中，Wang 等[26]檢測了circRNAs 和腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)之間的關系，發(fā)現(xiàn)在雄激素受體表達增加的ccRCC 中，circHIAT1 通過雄激素受體介導的circHIAT1/miR-195-5p/29a-3p/29c-3p/CDC42 信號通路，抑制癌細胞遷移和侵襲。最新研究表明circTLK1 作為miR-136-5p 海綿促進腎細胞癌的增殖及轉移[27]。在前列腺癌的研究中，已有研究表明circ-SMARCA5 通過抑制細胞凋亡和調節(jié)細胞周期等方式促進疾病進展[28]。另有研究通過對CRISPR 全基因組篩選，證實HNRNPL 作為一種RNA 結合蛋白調控RNA 的可變剪接，包括PCa 特異性的癌基因，也可以通過調控反向剪接方式促進circRNAs 形成，參與PCa發(fā)展[29]。

3.4 circRNAs與女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤

乳腺癌和卵巢癌一直是威脅女性健康的重要因素，circRNAs相關研究為指導治療這兩種癌癥帶來了新的希望。在乳腺癌研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)circ-ABCB10在癌組織中顯著高表達，通過吸附miR-1271 促進腫瘤發(fā)生[30]。Liang 等[31]報道circCDYL 在轉移性乳腺癌患者腫瘤組織和血清中高表達，進一步研究表明轉移性乳腺癌患者血清中circCDYL 的含量與患者預后呈顯著負相關，這表明血清circCDYL 含量可以作為乳腺癌患者預后的生物標志物。Zheng 等[32]發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中circSEPT9 高表達，通過競爭性結合miR-637 激活LIF/STAT3 通路，另外，該circRNA 與臨床分期及不良預后有關。卵巢癌方面，Bachmayr-Heyda等[33]證明卵巢癌細胞增殖與circRNAs 的總體表達豐度相關。Ahmed 等[34]通過對3 例IIIC期卵巢癌患者的原發(fā)部位、腹膜和淋巴結轉移病灶進行了測序分析，結果表明，差異表達的circRNAs 的數量明顯多于mRNA。

3.5 circRNAs與血液系統(tǒng)惡性腫瘤

多種惡性血液病是由異常染色體易位編碼的融合基因導致的，而許多ncRNAs的表達是通過復雜的染色體重排機制形成的，那么二者之間可能存在一定的聯(lián)系，染色體重排可直接生成融合circRNAs。許多癌癥相關的融合基因可能會產生多種circRNAs如circPR和circM9_1，這些circRNAs具有促進增殖和作為原癌基因的特性。You等[35]通過對RNA-Seq數據分析鑒定了急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性早幼粒細胞白血病患者之間差異表達的circRNAs，這些數據支持融合基因表達的circRNAs 促進血液系統(tǒng)惡性腫瘤進展的觀點。除此之外，Li等[36]在115例AML樣本中發(fā)現(xiàn)了顯著下調的circRNA-has_circ_0004277，標準化療可以恢復該circRNA 及其相應的線性轉錄本亞型WDR37 的表達，提示has_circ_0004277可能影響化療反應或疾病進展。

3.6 circRNAs與其他腫瘤

CircRNA 在其他多種腫瘤的發(fā)病機制中也起著關鍵作用。例如，骨肉瘤研究中[37]，有報道表明hsa-circ-0016347 通過靶向作用miR-214 上調caspase-1 的表達促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和轉移；circUBAP2 通過miR-143 增強靶基因Bcl-2的表達和功能來促進骨肉瘤的發(fā)展；hsa_circ_0001564 的表達水平在骨肉瘤組織中增加并且通過作用于miR-29c-3p促進腫瘤形成；hsa_circ_0009910 通過調控hsa_circ_0009910/miR-449a/IL6R 作用通路來促進骨肉瘤的進展。在其他腫瘤中，hsa_circRNA_100395/miR-141-3p/miR-200a-3p 通路可能參與乳頭狀甲狀腺腫瘤的發(fā)展[38]，cZNF292和circ-TTBK2分別通過Wnt/β-catenin 和miR-217/HNF1β/Derlin-1 途徑調節(jié)神經膠質瘤進展[39]；Yang 等[9]研究結果表明circ-FBXW7I 可編碼功能蛋白FBXW7-185aa，在神經膠質瘤中具有潛在的預后意義。

4 問題與展望

隨著研究的不斷深入，circRNAs 的功能開始受到廣泛關注，因其具有miRNAs吸附和蛋白質結合功能，能夠影響基因的轉錄、剪接及轉錄后調控等作用，說明其在細胞生物功能調控方面具有較深遠的研究意義。目前circRNAs 的研究尚有幾個方面需要改進，首先，隨著研究的不斷深入，越來越多的circRNAs 被鑒定出來，然而，與之前的ncRNAs 一樣，目前面臨的主要問題是命名標準不統(tǒng)一。因此，如何為circRNAs 命名設計一個簡單且具有唯一性的方式是亟待解決的問題。另一方面是缺乏對circRNAs 更為深入的了解，目前我們對circRNAs 的了解主要集中在檢測層面，事實上，circRNAs 是如何生成的，以及機體是如何去除circRNAs 來調節(jié)circRNAs的含量我們還不是很清楚。另外，目前我們關于circRNAs 對腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究越來越多，雖然腫瘤的種類在不斷增加，但是機制并未出現(xiàn)創(chuàng)新，絕大多數都停留在miRNAs海綿吸附的功能，事實上，circRNAs的功能不僅于此，它們在腫瘤進展中的機制也絕不會僅僅是這單獨的一兩方面，除了上述總結的circRNAs功能外，仍有許多作用機制值得我們進一步探索，比如，circRNAs 具有不同的亞細胞定位，像CDR1as 這種circRNA 可以結合或者通過自身降解釋放miRNAs，那么它是否能夠充當轉運載體來調節(jié)不同條件下亞細胞結構內的miRNAs 含量，進而調節(jié)細胞生物學功能？還有，circRNAs 既可以結合mRNA，又可以結合蛋白質，它是否可以作為中介橋梁，使mRNA或蛋白質相互靠近促進兩者之間發(fā)生作用，或者作為整體發(fā)揮生物學功能，這種復合物的主要成分又是什么？

另外，circRNAs本身表達量并不高，它是如何有效的競爭結合miRNAs或蛋白質的，這些都是需要我們考慮的問題。盡管許多研究已經證明了circRNAs 在疾病治療中的潛在作用，由于其作用效果不確定，尚無法應用于臨床中，雖然許多circRNAs 已被證實和腫瘤存在相關性，但無臨床數據可供參考。總之，circRNAs具有其獨特的特點，對于研究疾病的發(fā)生機制，能否作為診斷的生物標記物，抑或是作為治療的靶點都有重要的研究價值，我們需要對其加深了解，其重要的功能和機制有待我們去發(fā)現(xiàn)。