黃超培，覃輝艷，張陸娟，王彥武，何 勵，傅偉忠

(廣西壯族自治區(qū)疾病預防控制中心，廣西南寧 530028)

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa) 是一種薔薇科灌木，因具有較高的經(jīng)濟和生態(tài)價值，二十多年前從國外陸續(xù)引進我國種植，其果實含有豐富的營養(yǎng)和生物活性成分，具有較強的抗氧化、消炎、抗菌等功效[1-2]，已被用于食品、保健品、化妝品等產(chǎn)品[3-4]，具有很好的應用前景。近年來，對黑果腺肋花楸果提取物的成分及活性物的功效作用研究比較多，而對它的毒性方面則少見報道，本文依據(jù)食品安全性毒理學評價程序和方法對其進行急性毒性及致突變性研究，為對黑果腺肋花楸提取物的安全性進行評價及后期的相關產(chǎn)品研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

黑果腺肋花楸果提取物溶液，其主要功效成分為原花青素(含量為2.79%)，擬用于功能性保健食品，由山西某科技公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF 級健康成年昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心繁殖，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(桂)2014-0002，質量合格證號45000300000854、4500030 0000864。動物飼料由廣東省醫(yī)學實驗動物中心生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0002，質量合格證編號44200300016584。動物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號SYXK(桂)2016-0002。動物實驗室溫度為22～25 ℃，相對濕度為55%～70%。

1.3 試驗菌株

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株，購于美國MOLTOX公司。

1.4 實驗方法[5]

1.4.1 急性經(jīng)口毒性試驗采用最大耐受量試驗法，選取體質量為18～22 g 的昆明種成年小鼠20 只，雌、雄性各10只，試驗前禁食16 h，不限飲水。采用最大給藥量法，按0.02 mL/g 給小鼠灌胃黑果腺肋花楸果提取物溶液1次，濃度為20 mg/kg(原花青素的濃度為558 mg/kg)，灌胃后觀察、記錄小鼠的中毒表現(xiàn)，觀察14 d，以半數(shù)致死劑量(median lethal dose，LD50)評價受試物的急性毒性強弱。

1.4.2 細菌回復突變試驗采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102 四種試驗菌株，設8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個濃度組，同時設自發(fā)回變對照、溶劑對照和陽性誘變劑對照。自發(fā)回變對照不加受試物，其余條件相同。采用平板摻入法，將試驗菌株增菌液0.1 mL、受試溶液0.1 mL，代謝活化組再加入10% S9混合液0.5 mL，依次加入保溫的頂層培養(yǎng)基試管內，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，迅速均勻鋪開。每個濃度組的每種菌株做3 個平行皿，在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿的回變菌落數(shù)，計算各濃度組平均回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)的比值(mutaion ratio，MR)，以MR＞2 且存在濃度-反應關系者為陽性結果。重復試驗1次。

1.4.3 骨髓細胞微核試驗設2.5、5、10 g/kg 3 個濃度組， 同時設陰性( 溶劑) 對照和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)陽性對照，每組10 只25～30 g 的昆明種成年小鼠，雌、雄性各5 只。按0.02 mL/g給小鼠灌胃受試物2 次(間隔24 h)，于末次給受試物后6 h 處死小鼠，取胸骨骨髓制片，甲醇固定，Giemsa 染色，在油鏡下觀察每只小鼠的1 000 個嗜多染紅細胞(PCE)，計數(shù)含微核的細胞數(shù)，計算微核細胞率。同時計數(shù)200 個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值(PCE/NCE)。

1.4.4 精子畸形試驗劑量及對照組設計同1.4.3項，每組10只25～35 g的昆明種成年雄性小鼠，每天灌胃給受試物1 次，連續(xù)5 d，于末次給受試物后第30天處死動物，解剖取出兩側附睪，置生理鹽水中輕輕將其撕裂、搖晃，過濾取精子制片，伊紅染色，在高倍鏡下觀察每只小鼠的1 000 個完整精子，計算精子畸形率。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗動物的體質量、菌落數(shù)、微核細胞率、PCE/NCE及精子畸形率等指標的統(tǒng)計結果以xˉ±s表示。骨髓細胞微核試驗各組間的微核細胞率的均數(shù)比較采用Poisson分布的近似正態(tài)法進行統(tǒng)計分析，精子畸形試驗各組間的精子畸形率的均數(shù)比較采用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

給予黑果腺肋花楸提取物溶液14 d內，未發(fā)現(xiàn)小鼠有中毒體征和死亡，小鼠的進食和飲水未見異常，小鼠的體質量增長未受到明顯影響，見表1。觀察期結束解剖小鼠，肉眼觀察心臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、睪丸、卵巢及胃腸等主要器官組織未見異常。由此可見，該受試物對小鼠的急性經(jīng)口毒性LD50大于20 g/kg。

表1 黑果腺肋花楸提取物對小鼠的急性毒性試驗結果(n=10)

表2 黑果腺肋花楸提取物細菌回復突變試驗結果

2.2 細菌回復突變試驗

細菌回復突變試驗的結果見表2，在加入或不加入S9代謝活化系統(tǒng)，黑果腺肋花楸提取物各濃度組和陰性對照的4 種試驗菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)相接近，MR 值均小于2，且不存在濃度-反應關系，而各陽性對照物均可誘發(fā)測試菌株的回復突變菌數(shù)明顯增高，MR 值2.99～133.64，表明該受試物未呈現(xiàn)誘發(fā)測試菌株的回復突變效應。重復試驗的結果一致。

2.3 骨髓細胞微核試驗

骨髓細胞微核試驗的結果見表3，黑果腺肋花楸提取物各劑量組的微核率及PCE/NCE值與陰性對照組接近，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各劑量組的PCE/NCE值均不少于陰性對照組的20%，而CTX陽性對照組的微核率則顯著高于陰性對照組(P＜0.01)，提示未見該受試物對小鼠的骨髓細胞有損傷和抑制作用。

表3 黑果腺肋花楸提取物對小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響(n=10#)

2.4 精子畸形試驗

精子畸形試驗的結果見表4，黑果腺肋花楸提取物各劑量組的精子畸形率與陰性對照組接近，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而CTX 陽性對照組的精子畸形率則顯著高于陰性對照組(P＜0.01)，提示未見該受試物對雄性小鼠的精子產(chǎn)生畸變作用。

表4 黑果腺肋花楸提取物對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響(n=10)

3 討 論

黑果腺肋花楸被引進我國種植的時間不長，迄今未見有中毒報道，現(xiàn)有文獻尚無黑果腺肋花楸果實、果汁和提取物的任何有害和毒性作用的數(shù)據(jù)[6]。但是黑果腺肋花楸提取物是用化學溶劑乙醇(70%濃度)進行提取，再經(jīng)過濾、濃縮和干燥獲得的，除了含原花青素外，還含有多酚、黃酮等多種成分，在進行生產(chǎn)和推向市場之前，為了安全起見，對其進行毒理學安全性評價是必要的。

本研究檢測黑果腺肋花楸提取物的急性毒性，并聯(lián)合體外細菌回復突變試驗與哺乳動物體內骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗，分別檢測基因水平、體細胞染色體及生殖細胞基因的損傷作用，對其潛在的致突變性進行檢測。試驗結果，在給予黑果腺肋花楸提取物后，小鼠未出現(xiàn)中毒體征和死亡，急性經(jīng)口毒性LD50大于20 g/kg(原花青素的濃度為558 mg/kg)，按照我國的食品急性毒性(LD50)分級標準評價，該提取物的急性經(jīng)口毒性屬于無毒級；在體外細菌回復突變試驗，加入和不加入S9代謝活化系統(tǒng)兩種條件下，黑果腺肋花楸提取物8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個濃度組的4 種試驗菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變的菌落數(shù)相接近，MR值均小于2，實驗結果為陰性；在哺乳動物體內，黑果腺肋花楸提取物2.5、5、10 g/kg 3 個濃度組的微核率、PCE/NCE 值和精子畸形率，與陰性對照組比較均無顯著性差異，表明未對小鼠的骨髓細胞有損傷和抑制作用，也未對雄性小鼠的精子產(chǎn)生畸變作用。從以上結果來看，未發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸提取物有急性毒性和致突變性作用，初步認為黑果腺肋花楸提取物具有一定的安全性，可以開展后續(xù)的毒理學試驗以便對其進行更全面的安全性評價。但是，本研究只進行了體外細菌回復突變試驗和選用了一種嚙齒類動物進行體內試驗，未選用非嚙齒類動物進行試驗，同時僅用成年動物進行試驗，未能反映年幼和老年動物的體內反應，這樣得到的研究結果有一定的局限性，有待進一步深入研究。