吳 朋， 鄧聿杉， 陳 放， 徐 鶯

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610065)

1 引 言

核糖體失活蛋白(Ribosome inactivating proteins，RIPs)能通過其rRNA N-糖苷酶活性去除核糖體28S rRNA上特異位置腺嘌呤的糖苷鍵從而抑制蛋白質(zhì)合成[1].因其具有抗腫瘤、抗病毒和抗真菌等多種生物學(xué)活性而受到關(guān)注[2].

Curcin和curcin C均是從大戟科麻瘋樹屬植物麻瘋樹(Jatrophacurcas)中分離得到的核糖體失活蛋白.1976年，Stripe首次從麻瘋樹胚乳中分離出curcin[3]，Barbieri等認(rèn)為其屬于I型RIPs[4].2002年，林娟[5]等人確定其分子量為28.2 kDa，具有rRNA N-糖苷酶活性.2017年，Zhang等人[6]從麻瘋樹完全伸展開的子葉中分離純化出一種新型I型核糖體失活蛋白curcin C.研究表明，curcin和curcin C的氨基酸序列同源性達(dá)到81.88%，但抗腫瘤活性存在較大的效率差異(例如后者對骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性可達(dá)前者的10倍)[6-7]，這表明兩者的催化效率或作用機(jī)制可能存在差異.我們注意到兩種核糖體失活蛋白的蛋白體外翻譯抑制的IC50分別為0.19和0.05nM，暗示它們的rRNA N-糖苷酶活性可能同樣也存在差異[6-7].由于造成酶活性差異的主要原因是蛋白的底物結(jié)合和催化中心，RIPs在完成其rRNA N-糖苷酶活性時(shí)，首先需要與底物分子特異位點(diǎn)的腺嘌呤結(jié)合.兩種蛋白是否因?yàn)樵诮Y(jié)合腺嘌呤上存在差異，因而進(jìn)一步導(dǎo)致活性的不同目前還不清楚.為了回答這一問題，本文利用生物信息學(xué)方法，首先預(yù)測出curcin、curcin C蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，并對模型質(zhì)量進(jìn)行優(yōu)化和評估，之后采用分子對接方法探究curcin，curcin C與腺嘌呤相互作用位點(diǎn)的比較分析，為闡明其活性差異的潛在機(jī)制提供一種的線索.

2 材料與方法

2.1 材 料

麻瘋樹核糖體失活蛋白curcin (GenBank登記號：AAL58089.1) 以及curcin C (GenBank登記號：ABZ04128.1) 的氨基酸序列由NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm. nih.gov) 檢索獲得.

2.2 方 法

2.2.1 序列檢索與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線預(yù)測軟件SWISSMODEL[8-12](https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測curcin、curcin C的三維模型.

2.2.2 模型優(yōu)化 采用SYBYL軟件，選用AMBER7 FF99力場和AMBER電荷對curcin和curcin C模型進(jìn)行能量最小化處理.

2.2.3 模型評估 為了進(jìn)一步確定模型的有效性，我們采用PROCHECK[13]、VERIFY 3D[14-15]、ERRAT[16]對模型進(jìn)行評估.

2.2.4 分子對接 分子對接實(shí)驗(yàn)使用AutoDock 4.2[17]，以鑒定curcin、curcin C與腺嘌呤可能的相互作用殘基.對蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理：加氫、計(jì)算電荷、分配原子AD4類型；對腺嘌呤小分子做加氫以及計(jì)算電荷處理.設(shè)置GridBox大小在X、Y、Z軸分別為60、64、50 ?，間距為0.375 ?[18].蛋白質(zhì)為剛性結(jié)構(gòu)，小分子配體為柔性結(jié)構(gòu).選擇遺傳算法(Genetic Alogorithm)，尋找蛋白質(zhì)受體上配體合適的結(jié)合位置.

3 結(jié)果與討論

3.1 Curcin和curcin C的三維建模和初步評估

通過序列和結(jié)構(gòu)比對，尋找一個(gè)與curcin、curcin C同源的由實(shí)驗(yàn)測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，本次建模選擇的模型PDB id為1IFS，為蓖麻ricinA鏈和游離腺嘌呤形成的復(fù)合體[19].其中ricin A鏈與curcin、curcin C的氨基酸序列相似度分別為36.48%、34.69%，均大于30%，滿足了SWISSMODEL三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測的需求.在此基礎(chǔ)上，預(yù)測出curcin、curcin C的三維結(jié)構(gòu)示意圖(圖1A、B).為了判斷所預(yù)測結(jié)構(gòu)的質(zhì)量，采取QMEAN軟件對上述預(yù)測結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)(圖1C、D).分值分別是-2.97、-2.87，表明curcin、curcin C模型質(zhì)量合格.其中curcin模型具有10個(gè)α-螺旋，10個(gè)β-折疊；curcin C模型具有12個(gè)α-螺旋，8個(gè)β-折疊.導(dǎo)致α-螺旋差異的兩處位置分別是curcin的Ala56-Ala57對應(yīng)curcin C中為 Thr56-Thr57、Pro134對應(yīng)為Ser134.造成β-折疊差異的兩處位置分別是curcin的Ser78對應(yīng)curcin C的Leu78、Glu81對應(yīng)為Lys81.

3.2 Curcin和curcin C模型的評估

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要取決于原子的最小能量排列，通過能量最小化的優(yōu)化可以使預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更接近自然狀態(tài)[18].將上述預(yù)測出的模型經(jīng)SYBYL軟件能量最小化優(yōu)化后，curcin、curcin C模型總能量分別從-3 033.609 kcals/mol和-3 072.181 kcals/mol降低至-5 073.993 kcals/mol和-5 316.474 kcals/mol.為了進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化前后curcin、curcin C模型的準(zhǔn)確性，采取PROCHECK、VERIFY 3D、ERRAT三個(gè)軟件對模型質(zhì)量進(jìn)行評估.結(jié)果如下：應(yīng)用PROCHECK的評估表明，優(yōu)化前curcin、curcin C的允許區(qū)域和額外允許區(qū)域百分比之和分別為98.1%(圖2A)和97.8%(圖2B)，優(yōu)化后分別為97.7%(圖2C)和97.8%(圖2D).可以發(fā)現(xiàn)優(yōu)化對于模型的分值影響不大，所有的分值均大于90%.對curcin C來說，沒有發(fā)生變化；對于curcin來說，分值甚至減小.VERIFY 3D評估表明，優(yōu)化使得兩個(gè)模型的分值都得到提高.前curcin、curcin C分別有88.21%(圖2E)、80.97%(圖2F)的殘基擁有大于0.2的3D/1D值，優(yōu)化后分別為94.31%(圖2G)、86.23%(圖2H).ERRAT的評估結(jié)果類似于VERIFY 3D，優(yōu)化前curcin、curcin C的得分分別是96.581(圖2I)、97.046(圖2J)，優(yōu)化后分別為98.312(圖2K)、90.377(圖2L)，即優(yōu)化使得模型的質(zhì)量提高，不過值得指出的是優(yōu)化前后的分值均大于85.綜上分析結(jié)果提示優(yōu)化前后的curcin和curcin C模型均具有較好的質(zhì)量，都可用于下一步分析.

圖1 基于SWISS MODEL預(yù)測的curcin和curcin C三維結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 Curcin、curcin C模型的質(zhì)量評估

圖3 Curcin和curcin C與腺嘌呤相互作用示意圖

3.3 與腺嘌呤分子的對接研究

為了預(yù)測和比較curcin和curcin C與腺嘌呤的相互作用位點(diǎn)，采用AutoDock 4.2軟件將腺嘌呤分別與優(yōu)化前后的curcin和curcin C模型進(jìn)行對接分析，選取結(jié)合能最低的對接結(jié)果并使用UCSF Chimera v.1.12.1[20]和LigPlot+[21]軟件進(jìn)行可視化(圖3).可以看見優(yōu)化前后的curcin模型氨基酸殘基與腺嘌呤相互作用的結(jié)合能分別為-7.52kJ/Mol和-5.32kJ/Mol.優(yōu)化前的curcin模型與腺嘌呤分子共形成3個(gè)氫鍵，其中Leu119與腺嘌呤的N10形成氫鍵，Gly157分別與腺嘌呤的N1、N4形成氫鍵，Tyr118、Tyr159、Ile204、Pro208則與腺嘌呤形成疏水相互作用(圖3A,3B).優(yōu)化后的curcin模型則是通過Glu90與腺嘌呤的N1形成一個(gè)氫鍵， Try73、Phe86、Asp88、Gly112與腺嘌呤具有疏水相互作用(圖3C,3D).優(yōu)化前后的curcin C模型氨基酸殘基與腺嘌呤相互作用的結(jié)合能分別為-8.2kJ/Mol和-5.29kJ/Mol.優(yōu)化前curcin C與腺嘌呤也形成了3個(gè)氫鍵，分別為Leu119與腺嘌呤的N10、Gly157與N4、Arg212與N8之間，Ala117、Tyr118、Tyr159、Ile204、Pro208共5個(gè)氨基酸殘基則參與了與腺嘌呤的疏水相互作用(圖3E,3F).優(yōu)化后的curcin C模型的氨基酸殘基與腺嘌呤未形成氫鍵，僅Tyr114、Glu164、Glu193以及Asn194共4個(gè)氨基酸殘基參與了與腺嘌呤的疏水相互作用(圖3G,3H).

在上述四個(gè)對接組合中，可以看出，結(jié)合能最低的組合是優(yōu)化前的curcin C模型與腺嘌呤組合，該組合中分別有3個(gè)氨基酸殘基參與了氫鍵的形成，5個(gè)氨基酸殘基參與了與腺嘌呤的疏水互作，從數(shù)量上也是最多的.并且，我們還注意到，參與腺嘌呤互作的氨基酸殘基及其位置與ricin A非常類似，后者也是有3個(gè)氨基酸殘基(Val81、Gly121、Arg180)參與了氫鍵形成，5個(gè)氨基酸殘基(Ala79、Tyr80、Asn122、Tyr123、Ile172)參與了疏水互作(圖3I,3J).唯一的區(qū)別是Pro208替代了Ser158(ricin A中為Asn122)參與疏水作用.同樣地，我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化前的curcin模型與腺嘌呤組合的結(jié)合能也低于另外兩個(gè)優(yōu)化后模型組合，參與的氨基酸數(shù)量雖然相對較少，但也非常類似于ricin A.前期的研究顯示，在Ricin A鏈中Tyr80、Tyr123、Glu177、Arg180、Trp211是rRNA N-糖苷酶活性的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，而且這些位點(diǎn)在RIPs中高度保守.因此，優(yōu)化前的模型結(jié)構(gòu)雖然分值相對較低，但可能更接近真實(shí)狀態(tài).造成這一現(xiàn)象的原因則可能是在能量最小化優(yōu)化時(shí)，沒有考慮到該模型是在有腺嘌呤參與時(shí)形成的.當(dāng)然這也意味著優(yōu)化前的模型并非兩個(gè)核糖體失活蛋白游離時(shí)的狀態(tài).至于curcin和curcin C與腺嘌呤的相互作用存在差異，則提示它們的rRNA N-糖苷酶活性可能存在差異，至于這種差異是導(dǎo)致它們的抗腫瘤活性差異的原因需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.