黃雯潔， 阮 帥， 溫 芳， 王 惠， 魯曉娜， 王玉蘭， 胡 玥， 劉沈林， 舒 鵬

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 南京 210000； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 南京 210000)

1 引 言

石見穿系唇形科鼠尾草屬華鼠尾草SalviachinensisBenth的干燥地上部分，別名華鼠尾草、紫參、小丹參、石打穿等.其性味苦、辛、平，歸胃、肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、活血止痛、消腫散結(jié)的功效.民間主要用石見穿治療噎嗝、痰喘、赤白帶、癰腫、瘰疬等疾病[1].近年來石見穿作為抗腫瘤中藥被廣泛應(yīng)用于各組方中，其各活性成分的抗腫瘤作用在肺癌[2]、肝癌[3]、胃癌[4]、腸癌[5]等多種惡性腫瘤被證實(shí).現(xiàn)有研究已初步建立了石見穿的藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]，為進(jìn)一步分析石見穿的有效化合物成分，闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，我們使用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)石見穿水提物的主要化學(xué)成分進(jìn)行了解析，提供了更為全面的石見穿水提物成分信息，以供明確其體內(nèi)藥效活性成分.

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤，根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，胃癌在全球腫瘤發(fā)病率中居第五位，死亡率居第三位[7].手術(shù)和化療為胃癌主要治療手段，然而其不良反應(yīng)及毒副作用較為顯著，且難以發(fā)揮長(zhǎng)期抗腫瘤作用.中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、副作用小等優(yōu)勢(shì)，逐漸在腫瘤治療中得到科研工作者的重視.石見穿在胃癌中的抗腫瘤療效已經(jīng)得到多項(xiàng)研究證實(shí)[8-9].因此，本文在對(duì)石見穿進(jìn)行藥效成分分析的基礎(chǔ)之上，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)等生物信息平臺(tái)，從藥物、化學(xué)成分、靶點(diǎn)、疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，探究石見穿治療胃癌的作用機(jī)制.

2 材料與方法

2.1 材 料

石見穿藥材來源于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，購(gòu)自安徽大別山中藥飲片有限公司，批號(hào)：190601，產(chǎn)地：安徽，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)藥典》2015年版.經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院于瑞蓮副教授鑒定為為唇形科植物華鼠尾草SalviachinensisBenth的地上部分.標(biāo)本保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室.甲醇(TEDIA，批號(hào)18095056)、甲酸(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，批號(hào)20160412)、乙腈(Merch，批號(hào)1.00030.4000).

Ultimate 3000高效液相色譜儀(1000 mm×1000 mmm×1000 mm)、SIL-20A XR UFLC儀(日本Shimadzu公司)、Triple TOF 5600 System-MS/MS高分辨三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)、電子天平(天津天馬衡基儀有限公司)SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(南京文科儀器設(shè)備有限公司)、KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、PST-JY-10普力菲爾純水機(jī)(上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司).

2.2 方 法

2.2.1 供試品制備 取干燥石見穿藥材粉末1 g，精密稱定，加10倍量雙蒸水浸泡30 min，回流提取2次，第1次30 min，第2次20 min，合并兩次濾液，70 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用無水乙醇復(fù)溶至10 ml容量瓶中即可.

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Hedera C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(B)-0.1%甲酸甲醇(C)，梯度洗脫 (0～7 min,97%～97% B；7～15 min，97%～50% B；15～20 min，50%～10% B；20～25 min，10%～97% B；25～37 min，97%～97% B)，流速1 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL.DAD檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm.

2.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 500；離子源溫度550 ℃；氣簾氣流速40 L/min；霧化氣流速55 L/min；輔助氣流速55 L/min；噴霧電壓-4 500 V；去簇電壓-100 V.

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 使用Peakview 2.0軟件(美國(guó)AB SCIEX公司)，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的一級(jí)質(zhì)譜碎片信息及精確相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)合擬合分子式、質(zhì)量偏差范圍(δ)≤5×10-6，初步預(yù)計(jì)可能的化合物，再通過比對(duì)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)、質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合參考文獻(xiàn)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定.

2.2.5 胃癌疾病靶點(diǎn)及石見穿潛在活性成分篩選 在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“gastric cancer”“ gastric carcinoma” “stomach cancer”“ stomach carcinoma”檢索胃癌的相關(guān)靶點(diǎn).

藥物成分在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄過程到達(dá)靶器官發(fā)揮疾病治療作用，口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)是中藥成分參與體內(nèi)過程的關(guān)鍵參數(shù)，可作為藥物活性成分篩選指標(biāo)[10].將液質(zhì)聯(lián)用解析鑒定所得的化學(xué)成分在TCMSP平臺(tái)以O(shè)B和DL為參數(shù)進(jìn)行篩選，為盡可能全面篩選，將條件設(shè)定為OB≥25%，DL≥0.05.

2.2.6 篩選石見穿治療胃癌的潛在靶點(diǎn) 通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，將篩選后的活性成分轉(zhuǎn)化為SMILES結(jié)構(gòu)式，將SMILES結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction網(wǎng)站，對(duì)石見穿活性成分的所有潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè).本研究中以每個(gè)SMILES結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的Probabillity TOP20為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選.將潛在活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得石見穿治療胃癌的靶點(diǎn)集.

2.2.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析 將石見穿治療胃癌的靶點(diǎn)集導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為Homo sapiens，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析.GO富集分析由生物過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)三個(gè)部分組成.本研究中GO分析及KEGG分析均以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn).

2.2.8 構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)“蛋白-蛋白相互作用”網(wǎng)絡(luò) 將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為Homo sapiens，進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白間的相互關(guān)聯(lián)分析，導(dǎo)出文件中的node1、node2和組合分?jǐn)?shù)(combined score)信息，以組合分?jǐn)?shù)(combined score)≥0.4作為篩選條件，為盡可能全面探究蛋白相互作用關(guān)系，將“max number of interactors to show 1stshell”拓展為“no more than 10 interactors”.使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建蛋白-蛋白相互網(wǎng)絡(luò)(PPI)圖，節(jié)點(diǎn)(node)的大小、形狀變化和顏色深淺反應(yīng)自由度(Degree)大小，自由度越大，則越表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置.

3 結(jié)果與分析

3.1 石見穿鑒定所得的化學(xué)成分信息

按照上述液相色譜和質(zhì)譜條件對(duì)石見穿水提物樣品進(jìn)行分析，總離子流圖(TIC)見圖1，在正負(fù)模式下色譜峰均比較豐富.為了獲得盡可能多的信息，本文采用正負(fù)兩種離子的全掃描檢測(cè)模式對(duì)石見穿的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析.根據(jù)TOF-MS質(zhì)譜得到化合物的精確質(zhì)荷比(m/z)，Product Ion二級(jí)質(zhì)譜得到該質(zhì)量數(shù)的二級(jí)碎片離子，并參考相關(guān)文獻(xiàn)信息、結(jié)合化合物的化學(xué)鍵斷裂規(guī)律，對(duì)石見穿所含化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析，鑒定得到48個(gè)化合物，絕大多數(shù)成分為酚酸類化合物、另有少量黃酮類、萜類有機(jī)酸、多糖類物質(zhì)等.詳見表1.

3.1.1 酚酸類 石見穿中含有大量酚酸類物質(zhì)，為水溶性化合物，具有較強(qiáng)的藥理活性，是石見穿的最主要有機(jī)成分之一.研究根據(jù)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)從石見穿中鑒定得到的主要酚酸類物質(zhì)包括：丹參素(Danshensu)、原兒茶酸(Protocatechuic acid hesoxide)、原兒茶醛(Protocatechuic aldehyde)、丹參素葡萄糖(Danshensu-Glc)、綠原酸(Chlorogenic acid)、香豆酸(Coutaric acid)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)、丹酚酸A(Salvianolic acid A)、丹酚酸J(Salvianolic acid J)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)、丹酚酸C(Salvianolic acid C)、迷迭香酸甲酯(Methyl rosmarinate)、1-咖啡奎寧酸(1-Caeoylquinic acid)、4-咖啡奎寧酸(1-Caeoylquinic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、咖啡酸葡萄糖(Caffeic acid-Glc)、阿魏酸(Ferulic acid).

圖1 正(A)負(fù)(B)離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram in positive (A) and negative (B) ion mode

酚酸類物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析以峰Rt3.39 min、峰Rt30.461 min、峰Rt31.82 min為例，通過對(duì)保留時(shí)間、碎片離子信息及參考文獻(xiàn)對(duì)照，確定其分別為丹參素(Danshensu)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)及迷迭香酸(Rosmarinic acid).①保留時(shí)間為3.39 min，獲得m/z 197.045 6[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配出的分子式為C9H10O5，精確分子量誤差為0.3ppm，根據(jù)文獻(xiàn)[11]初步判定該峰為丹參素，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2A.二級(jí)質(zhì)譜圖中，此物質(zhì)在m/z197處產(chǎn)生大量的[M-H]-離子，并呈現(xiàn)m/z179[M-H-H2O]-和m/z135[M-H-H2O-CO2]-碎片離子，切合丹參素存在芳環(huán)上的鄰羥基,極易脫去一分子H2O后再脫去一分子CO2產(chǎn)生的特性.②保留時(shí)間為30.461 min，獲得m/z359.075 56[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配出的分子式為C18H16O8，精確分子量誤差為-1.6 ppm，根據(jù)文獻(xiàn)[27]判定該峰為迷迭香酸(Rosmarinic acid)，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2B，m/z197為其母離子丟失一分子咖啡酸形成，另外可見丹參素的特征碎片m/z179、m/z135、m/z123.③保留時(shí)間為31.82 min，呈現(xiàn)m/z717.1443[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，匹配分子式為C36H30O16，精確分子量誤差為-2.5 ppm，結(jié)合文獻(xiàn)[13]判定該峰為丹參素的多聚體丹酚酸B(Salvianolic acid B)，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2C，其結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)丹參素片段，分別失去一分子和兩分子丹參素得到碎片離子m/z519[M-H-C9H10O5]-和m/z321[M-H-2(C9H10O5)]-，少數(shù)m/z519發(fā)生麥?zhǔn)现嘏?，失?80Da，得到碎片m/z339，隨后側(cè)鏈斷裂，產(chǎn)生碎片m/z295，繼而再失去一分子H2O，產(chǎn)生碎片m/z 277.同理鑒定得到丹酚酸A(Salvianolic acid A)、丹酚酸J(Salvianolic acid J)、丹酚酸C(Salvianolic acid C)等酚酸類成分.

圖2 丹參素(A)、迷迭香酸(B)、丹酚酸B(C)及山奈酚(D)的二級(jí)質(zhì)譜圖

3.1.2 黃酮類 黃酮類化合物在質(zhì)譜中易于電離，碎片信息豐富，一般都具有C6-C3-C6的基本母核結(jié)構(gòu)，本研究在石見穿中鑒定得到的黃酮類物質(zhì)主要有：山奈酚(kaempferol)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷及山奈酚-3-O-葡萄糖苷.

黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析以峰Rt35.52 min為例，保留時(shí)間35.52 min，獲得準(zhǔn)分子離子峰m/z287.0551[M+H]+，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配出的分子式為C15H10O6，精確分子量誤差為0.3 ppm，通過對(duì)保留時(shí)間、碎片離子信息及參考文獻(xiàn)[14]對(duì)照，初步鑒定為山奈酚(kaempferol)，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2D，主要離子碎片m/z153[M+H-C8H6O2]+是由準(zhǔn)分子離子m/z287.0551[M+H]+C環(huán)上RDA裂解形成，m/z121 [M+H-C8H6O2-CO2]+由母離子m/z 153脫去一CO2產(chǎn)生，另外質(zhì)譜中可見其他離子碎片m/z213、m/z165、m/z157、m/z137、m/z135等，與文獻(xiàn)報(bào)道一致.同理鑒定得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷及山奈酚-3-O-葡萄糖苷等黃酮類成分.

3.1.3 其他 另外，石見穿中還鑒定出了萜類有機(jī)酸，包括羥基積雪草酸(madecassic acid)、五靈脂三萜酸(goreishic acid)、積雪草酸(asiatic acid)、阿江欖仁酸(Arjunolic acid)；香豆素類成分，包括6-羥基香豆素(6-Hydroxycoumarin)、8-羥基香豆素(8-Hydroxycoumarin)、7-羥基香豆素(7-Hydroxycoumarin)等以及氨基酸類物質(zhì)如色氨酸(tryptophan)等.

3.2 石見穿活性成分及治療胃癌靶點(diǎn)分析

3.2.1 胃癌靶點(diǎn)及石見穿潛在活性成分篩選 經(jīng)DisGeNET庫(kù)檢索(根據(jù)Uniprot ID號(hào)刪除重復(fù)靶點(diǎn))共得到3770個(gè)胃癌疾病靶點(diǎn)，計(jì)算sore gad的平均值，篩選出sore gad≥0.049552的疾病靶點(diǎn)共740個(gè).將液質(zhì)聯(lián)用解析鑒定結(jié)果在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及條件篩選后，共得到9個(gè)具有良好生物學(xué)活性的化合物，具體見表2.

表2 石見穿體內(nèi)活性成分表

3.2.2 石見穿活性成分治療胃癌的潛在靶點(diǎn)分析 將石見穿活性成分每個(gè)SMILES結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的Probabillity TOP20作為潛在活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與胃癌疾病靶點(diǎn)取交集，共獲得石見穿活性成分治療胃癌的潛在靶點(diǎn)18個(gè)，具體見表3.

3.2.3 GO富集分析與KEGG通路富集分析 GO富集分析結(jié)果表明，石見穿在胃癌治療中共涉及到48個(gè)生物過程(BP)，8個(gè)細(xì)胞組分(CC)以及27個(gè)分子功能(MF).

生物過程方面，石見穿主要對(duì)藥物反應(yīng)(Reponse to drug)、細(xì)胞藥物反應(yīng)(Cellular response to drug)、細(xì)胞流體剪切應(yīng)力反應(yīng)(Cellular response to fluid shear stress)、蛋白質(zhì)分解代謝過程的負(fù)調(diào)控(Negative regulation of protein catabolic process)、胚胎植入(Embryo implantation)、一氧化氮生物修復(fù)

表3 石見穿活性成分治療胃癌的靶點(diǎn)

過程的正調(diào)控(Positive regulation of nitric oxide biosunthetic process)、膠原分解代謝過程(Collagen catabolic process)、對(duì)雌激素的反應(yīng)(Response to estrogen)等生物過程進(jìn)行調(diào)節(jié).

細(xì)胞組分方面，石見穿對(duì)質(zhì)膜(Plasma membrane)、細(xì)胞質(zhì)(Cytosol)、基底外側(cè)質(zhì)膜(Basolateral plasma membrane)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)(Perinuclear region of cytoplasm)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(proteinaceous extracellular matrix)、頂端質(zhì)膜(Apical plasma membrane)、細(xì)胞核(Nucleus)、細(xì)胞外隙(Extracelluar space)的作用較為顯著.

分子功能方面，石見穿主要通過對(duì)酶結(jié)合(Enzyme binding)、蛋白結(jié)合(Protein binding)、鋅離子結(jié)合(Zinc ion binding)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性和配體激活的序列特異性DNA結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity,ligand-activated sequence-specific DNA binding)、ATP酶活性與物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)(ATPase activity,coupled to transmembrane movement of substances)、相同蛋白結(jié)合(Identical protein binding)、異種運(yùn)輸ATP酶活性(Xenobiotic-transporting ATPase activity)、芳香酯酶活性(Arylesterase activity)、金屬內(nèi)肽酶活性(Metalloendopeptidase activity)等分子功能發(fā)揮胃癌治療作用.

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，除去與胃癌無關(guān)通路，石見穿在胃癌治療中共涉及8條通路.富集潛在靶基因排名前五的通路依次為腫瘤通路(Pathways in cancer)、粘附連接(Adherens junction)、雌激素信號(hào)途徑(Estrogen siganaling pathway)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC transports)、腫瘤微小RNA(MicroRNAs in cancer).

使用R語(yǔ)言將GO分析與KEGG分析結(jié)果(按p值升序排列TOP10)分別繪制成氣泡圖，圖中氣泡大小代表富集基因數(shù)的多少，氣泡顏色差異代表靶基因富集的顯著性大小(見圖3).

圖3 GO富集分析與KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.3 Bubble diagram of GO analysis and KEGG analysis

3.2.4 “蛋白-蛋白相互作用”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖中共包含節(jié)點(diǎn)(node)35個(gè)，邊(edge)150條，平均節(jié)點(diǎn)度(average node degree)為8.57，平均局部聚類系數(shù)(avg. local clustering coefficient)為0.65，PPI豐度P值(PPI enrichment p-value)<1.0e-16.本文通過將“max number of interactors to show 1st shell”設(shè)為“no more than 10 interactors”以拓展探究蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果顯示處于核心位置Top5的靶點(diǎn)為EGFR(23)、CDH1(20)、CTNNB1(19)、PTGS2(19)、EGF(18)，提示其在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.(見圖4).

圖4 石見穿治療胃癌靶點(diǎn)的PPI圖Fig.4 PPI map of targets of Salvia chinensis in the treatment of gastric cancer

4 討 論

利用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)可以得到高分辨率、高精度的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)及其裂解途徑并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，可較準(zhǔn)確的定性相關(guān)化學(xué)成分，因此，HPLC-Q-TOF-MS/MS應(yīng)用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定可為中藥多組分鑒定研究提供可靠依據(jù)，且具有廣闊的應(yīng)用前景[35].本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)譜同時(shí)結(jié)合正負(fù)兩種離子模式，均可采集到較豐富的色譜峰，為石見穿水提物樣品的準(zhǔn)確定性鑒定奠定基礎(chǔ).一級(jí)質(zhì)譜是準(zhǔn)確推測(cè)化合物分子結(jié)構(gòu)必要的數(shù)據(jù)，本研究在基于一級(jí)質(zhì)譜采集良好性基礎(chǔ)上，并對(duì)二級(jí)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，再結(jié)合化合物相關(guān)裂解規(guī)律及文獻(xiàn)，從而對(duì)石見穿鑒定出大量酚酸類、黃酮類等48個(gè)化合物成分.本研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)石見穿水提物成分的快速定性分析，該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高，為石見穿質(zhì)量控制、藥理作用、臨床應(yīng)用等研究奠定基礎(chǔ).

現(xiàn)有文獻(xiàn)已表明了石見穿在抗腫瘤方面的卓越效果[36]，本研究對(duì)其水提物進(jìn)行成分解析，分析得到48種化學(xué)成分，為現(xiàn)有石見穿成分研究中解析最為全面、所得成分最多的研究.同樣，在我們的研究中，也發(fā)現(xiàn)了石見穿中較具有代表性的幾種抗腫瘤成分，如丹參素、迷迭香酸、山奈酚等.與此同時(shí)，石見穿也是本研究團(tuán)隊(duì)治療胃癌臨床效方“健脾養(yǎng)胃方”中的主要抗腫瘤藥物.健脾養(yǎng)胃方由首屆全國(guó)名中醫(yī)劉沈林教授根據(jù)胃癌“脾虛毒瘀”的基本病機(jī)，通過二十多年的臨床實(shí)踐所創(chuàng)制的.其通過一項(xiàng)歷時(shí)8年、納入病例489例、有9個(gè)協(xié)作單位參研的多中心大樣本國(guó)家中管局行業(yè)專項(xiàng)課題研究[37]，證實(shí)在進(jìn)展期胃癌術(shù)后協(xié)同化療，與單純化療相比，可使復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)下降32.8%(P=0.004 2)；尤其對(duì)于胃癌Ⅲ期患者，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更是下降了34.7%(P=0.007 2).本方治療胃癌臨床療效顯著，石見穿作為組方中的重要抗腫瘤藥物，其治療胃癌的活性成分、作用靶點(diǎn)機(jī)制有待發(fā)掘.因此，在對(duì)該藥藥學(xué)分析基礎(chǔ)上，我們運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選出9個(gè)具有良好生物學(xué)活性的化合物，以胃癌治療為研究對(duì)象，獲得了石見穿活性成分治療胃癌的18個(gè)潛在靶點(diǎn)，常見重要靶點(diǎn)例如EGFR、CDH1、CTNNB1、PTGS2、EGF等，這些靶點(diǎn)在PPI圖中均位于核心位置，是連接多蛋白相互作用的重要基因.其中，EGFR家族對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控已得到廣泛研究，胃癌以異質(zhì)模式過表達(dá)HER，尤其是EGFR和HER2，其在胃癌的細(xì)胞增殖和遷移中具有關(guān)鍵作用[38].以迷迭香酸類似物為代表的多種中藥成分，可降低胃癌細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡[39].EGF[40]作為上游通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移，以EGF-Grb2-DENND1A-Rab35信號(hào)通路與DENND1A和Grb2的相互作用可以調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲.在石見穿治療胃癌的通路方面，KEGG富集分析預(yù)測(cè)了8條潛在通路，其中，粘附連接、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體為我們熟知的腫瘤調(diào)控重要通路.粘附連接途徑包括了CREBBP、EP300、CDH1、CTNNB1、EGFR、MET、TGFBR2和ERBB2等多基因調(diào)控.Ge等[41]通過對(duì)78例進(jìn)展期胃癌患者組織的全基因組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)在粘附連接途徑中具有一個(gè)或多個(gè)突變的患者具有更好的總體生存率.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是與胃癌多藥耐藥密切相關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，其最主要蛋白為ABCB1，此外還有ABCC1/ABCC2蛋白以及ABCG2蛋白，抑制這些蛋白表達(dá)可有效降低化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的外排，直接降低耐藥的發(fā)生[42].

然而石見穿藥物成分復(fù)雜，抗腫瘤機(jī)制亦趨于多方面多維度，本研究?jī)H為該藥成分的定性分析鑒定及通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)其治療胃癌潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè).對(duì)于不同成分的含量分析、藥物活性分析及中藥用藥的毒理性分析尚待后續(xù)代謝組學(xué)等的進(jìn)一步研究[43]，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用靶點(diǎn)及通路機(jī)制，闡明其對(duì)胃癌的治療作用，為石見穿更廣泛的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).