程麗麗 潘 櫻 林 艷 林仕雄 童再康 張俊紅

(浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，在植物生命活動(dòng)中具有不可替代的作用，是影響植物生產(chǎn)和質(zhì)量的關(guān)鍵因素[1-2]。氮代謝途徑紊亂會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)與形態(tài)造成不利影響，顯著影響植物根系發(fā)育、葉綠素含量及種子產(chǎn)量等[3]。施用氮肥可促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)，但隨著氮肥施用量增加其利用效率逐年降低，同時(shí)造成農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降、生產(chǎn)成本提高和生態(tài)環(huán)境惡化等問題[4-5]。因此，利用植物自身遺傳變異，挖掘植物本身利用養(yǎng)分的潛力，篩選和培育耐低氮、氮高效利用的新品種是解決這些問題的理想途徑之一[6]。

光皮樺(Betulaluminifera)為樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula)落葉喬木，是我國(guó)特有的優(yōu)良速生用材樹種[7]。光皮樺材質(zhì)優(yōu)良、用途廣、病蟲害少，是近年來我國(guó)南方山區(qū)大力發(fā)展的重要用材樹種[8]。然而，由于南方山區(qū)土壤中可利用氮源較少，缺氮成為影響光皮樺生產(chǎn)的重要因素。研究表明，植物可感知外界逆境脅迫信號(hào)，通過自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)在生理和形態(tài)上產(chǎn)生響應(yīng)，以增強(qiáng)在脅迫條件下的生存機(jī)會(huì)[9-10]，且植物不同基因型在礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收和利用方面存在顯著的遺傳差異[11]。目前對(duì)植物不同基因型氮素利用差異的研究主要集中于小麥(Triticumaestivum)[1]、玉米(Zeamays)[12]、大麥(Hordeumvulgare)[4]和甘蔗(Saccharumofficinarum)[13]等農(nóng)作物，關(guān)于林木氮生理效率的遺傳和育種研究較少。樊瑞懷等[14]研究不同基因型馬褂木(Liriodendronchinense)的氮素脅迫響應(yīng)，將參試家系劃分為穩(wěn)定型高氮效率家系和敏感型低氮效率家系兩大類，并結(jié)合不同氮素下的生長(zhǎng)表現(xiàn)進(jìn)一步分為生長(zhǎng)優(yōu)良和生長(zhǎng)劣勢(shì)家系。Luo等[15]研究發(fā)現(xiàn)速生楊群眾楊(Populuspopularis)和慢生楊銀腺楊(P.alba×P.glandulosa)在低氮脅迫下根表型和光合作用等響應(yīng)存在顯著差異，速生楊的氮代謝在低氮條件下較慢生楊更敏感。Zhang等[16]研究表明低氮脅迫對(duì)青楊(P.cathayana)雌株影響比雄株更大，低氮脅迫下雄株葉綠素含量、氮生理利用效率、谷氨酸脫氫酶和過氧化氫酶活性比雌株更高，且葉綠素超顯微結(jié)構(gòu)更完整。

本研究以3個(gè)光皮樺基因型為試驗(yàn)材料，通過正常供氮和低氮脅迫分別處理水培光皮樺幼苗，分析不同光皮樺基因型在低氮脅迫下的生長(zhǎng)和生理生化指標(biāo)變化，探索光皮樺適應(yīng)低氮環(huán)境的生理機(jī)制，以期為耐低氮脅迫種質(zhì)的篩選和培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用浙江農(nóng)林大學(xué)珍貴樹種育種課題組前期篩選的光皮樺G49-3、G50-1和優(yōu)3三個(gè)基因型的組培苗為供試材料。組培苗繼代于1/2 MS固體培養(yǎng)基，2月苗齡時(shí)移植至基質(zhì)(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1)，培養(yǎng)30 d后移入水培裝置，適應(yīng)培養(yǎng)30 d。水培條件為：白天25℃，晚上20℃，16 h光/8 h暗，光照強(qiáng)度120 μmol·m-2·s-1。 試驗(yàn)前將試驗(yàn)材料饑餓處理7 d，期間以超純水培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在浙江農(nóng)林大學(xué)平山試驗(yàn)基地人工培養(yǎng)室進(jìn)行。基于前期不同氮濃度的試驗(yàn)及文獻(xiàn)[8]選取NO3-濃度。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制參照Georgieva[17]的方法，正常供氮組(control，CK)NO3-濃度為15 mmol·L-1； 低氮脅迫組(low nitrogen，LN)NO3-濃度為0.03 mmol·L-1，缺失的K+以濃度為4.97 mmol·L-1KCl補(bǔ)齊，配方參照文獻(xiàn)[18]。本試驗(yàn)采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，氮素處理為主區(qū)(A)：CK(A1)和LN(A2)；基因型為副區(qū)(B)：G49-3(B1)、G50-1(B2)和優(yōu)3(B3)，均按完全隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)5次。

光皮樺苗處理21 d后于當(dāng)日上午11時(shí)對(duì)每個(gè)基因型幼苗取樣，測(cè)定3個(gè)基因型植株的株高、葉片和根系表型，葉綠素含量，過氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和硝酸還原酶(nitric reductase，NR)活性等指標(biāo)。并分別取各基因型的根和葉經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱，備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生物量、葉綠素含量和氮含量測(cè)定 將植株從水培裝置中取出，從根基部切斷，將植株分為地上部和根部，測(cè)定株高，并掃描根系。然后分別將地上部和根放入烘箱105℃殺青30 min，再75℃烘干至恒重并記錄。葉綠素含量測(cè)定采用丙酮-乙醇直接浸漬法[19]，于663、645 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，代入公式計(jì)算(Ca=12.71×A663-2.59×A645，Cb=22.88×A645-4.67×A663，C=8.04×A663+20.29×A645，以mg·g-1表示)。樣品經(jīng)H2SO4-H2O2消煮，利用微量凱氏定氮法[19]測(cè)定氮含量。

1.3.2 根系結(jié)構(gòu) 采用平板掃描儀Epson Perfection V700(RZGENT公司，加拿大)以800 dpi分辨率采集根系圖像，并利用WinRhizo根系分析系統(tǒng)分析總根長(zhǎng)、根系總表面積等根系形態(tài)指標(biāo)。

1.3.3 POD、SOD和NR活性測(cè)定 葉片POD和SOD活性分別采用過氧化物酶測(cè)定試劑盒(比色法[19])和總超氧化物歧化酶測(cè)試盒(羥胺法[19])測(cè)定，POD及SOD活性均以U·g-1FW表示。NR活性采用硝酸還原酶測(cè)定試劑盒測(cè)定，以μg· g-1·h-1FW表示。上述試驗(yàn)所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3.4 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)分析 采用CTAB+Trizol法分別提取光皮樺根和葉總RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit[寶生物工程(大連)有限公司]反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA第一鏈合成。采用StepOne Real-Time PCR system (Applied Biosystem，美國(guó)) 進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系(10 μL)：SYBR premix ExtaqⅡ 5.0 μL、Primer-F 0.4 μL、Primer-R 0.4 μL、cDNA 0.5 μL和ddH2O 3.7 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，循環(huán)39次；65～95℃作熔解曲線。RT-qPCR所用引物見表1，參考前期光皮樺內(nèi)參基因篩選結(jié)果，選擇 large ribosomal subunit 39 (RPL39)作為內(nèi)參基因(GenBank 登錄號(hào): KP245805)[8]。

表1 光皮樺硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因引物Table 1 Primers for nitrate transporter genes in B. luminifera

1.3.5 隸屬函數(shù)的計(jì)算方法 耐低氮系數(shù)K=低氮處理測(cè)定值/對(duì)照測(cè)定值。耐低氮綜合評(píng)價(jià)采用隸屬函數(shù)法綜合各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[20-21]，其計(jì)算公式為:

式中，i表示某個(gè)基因型；j表示某項(xiàng)指標(biāo)；Uij表示i基因型j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xjmin表示各基因型j指標(biāo)耐低氮系數(shù)最小值；Xjmax表示各基因型j指標(biāo)的耐低氮系數(shù)最大值。將各基因型所有性狀的隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加，求其平均值得各基因型的隸屬函數(shù)值Ui，Ui值越大表示耐低氮能力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Office Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫對(duì)不同基因型光皮樺幼苗的表型及葉綠素含量的影響

在CK和LN條件下處理21 d后，3個(gè)基因型光皮樺幼苗形態(tài)上發(fā)生變化。LN各基因型光皮樺幼苗不定根數(shù)量明顯增多，葉色發(fā)黃(圖1)，尤其嫩葉黃化，葉片較小，呈典型缺氮表型(圖2-a)。LN不同基因型光皮樺的葉綠素總量、葉綠素a和葉綠素b含量均顯著降低(圖 2-b～d)，且在不同基因型光皮樺間存在極顯著差異。

圖1 低氮脅迫處理21 d后3種基因型光皮樺的表型Fig.1 The phenotypes of three genotypes in B. luminifera after 21 days of treatment under LN stress

2.2 低氮脅迫對(duì)不同基因型光皮樺幼苗生長(zhǎng)的影響

由表2可知，與CK相比，LN各基因型光皮樺的株高、地上部干重、地上氮含量和氮積累量均呈下降趨勢(shì)，且不同基因型間存在極顯著差異，表明低氮脅迫對(duì)不同基因型光皮樺生長(zhǎng)的抑制程度不同，其中G49-3的株高和地上部干重的降幅達(dá)到顯著或極顯著水平，表明G49-3對(duì)低氮更敏感。3種基因型光皮樺地上氮含量和氮積累量下降均達(dá)到顯著或極顯著水平，且均是G49-3降幅最大，G50-1降幅最小，表明G50-1氮含量和氮積累量受低氮脅迫影響較小，表現(xiàn)出較強(qiáng)耐低氮能力，而G49-3對(duì)低氮脅迫更敏感。

表2 低氮脅迫下3種基因型光皮樺地上部生長(zhǎng)的差異Table 2 Differences in shoot growth of three genotypes in B. luminifera under LN stress

注：a: 光皮樺葉色比較，從頂端向下的第二、第三片葉子。 *表示相對(duì)于CK，LN達(dá)顯著水平(P<0.05)，** 表示達(dá)極顯著水平(P<0.01)。下同。Note: a: Comparison of leaf color in B. luminifera with the second and third leaves from the top. * indicates that LN has a significant level relative to CK(P<0.05), ** indicates a extremely significant level(P<0.01). The same as following.圖2 低氮脅迫下三種基因型光皮樺的葉色比較及葉綠素含量分析Fig.2 Comparison of leaf color and chlorophyll content of three genotypes in B. luminifera under LN stress

2.3 低氮脅迫對(duì)不同基因型光皮樺幼苗根系的影響

由表3可知，與CK相比，LN處理下3種基因型光皮樺的地下氮含量均呈下降趨勢(shì)，不同基因型間存在極顯著差異；其根干重、根冠比、總根長(zhǎng)、根系總表面積和平均直徑升高，表明低氮脅迫在一定程度上促進(jìn)了光皮樺地下部生長(zhǎng)。各指標(biāo)在不同基因型光皮樺間存在顯著或極顯著差異，但僅G50-1各項(xiàng)指標(biāo)變化均達(dá)到顯著或極顯著水平，表明G50-1能更好地響應(yīng)低氮脅迫，進(jìn)而改變根系形態(tài)以攝取更多氮素，表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐低氮能力。

表3 低氮脅迫對(duì)3種基因型光皮樺根系的影響Table 3 Effects of LN stress on roots in three genotypes of B. luminifera

2.4 低氮脅迫下光皮樺幼苗保護(hù)酶活性的變化

低氮脅迫對(duì)不同基因型光皮樺保護(hù)酶系統(tǒng)的影響不同(圖3)，且不同基因型光皮樺間存在極顯著差異。LN處理后3種基因型光皮樺POD和SOD活性均降低，其中優(yōu)3的POD和SOD活性顯著降低，G49-3的POD和SOD活性極顯著降低。保護(hù)酶活性的變化差異說明不同基因型光皮樺響應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間低氮脅迫時(shí)的抵御能力不同，G50-1降幅最低，表明其對(duì)低氮脅迫的抵御能力最強(qiáng)。

圖3 低氮脅迫下3種基因型光皮樺的POD和SOD活性變化Fig.3 The changes of POD and SOD activity in three genotypes of B. luminifera under LN stress

2.5 低氮脅迫下光皮樺幼苗NR活性的變化

NR是植物氮同化過程中的第一個(gè)酶，也是硝酸鹽同化過程中的限速酶，其活性強(qiáng)弱與植物體內(nèi)氮同化能力密切相關(guān)，NR活性越強(qiáng)，氮素代謝越旺盛[22]。與CK相比，LN處理下3個(gè)光皮樺基因型的NR活性均極顯著降低(圖4)，基因型對(duì)光皮樺NR活性的影響存在極顯著差異，其中G49-3降幅最大。正常供氮時(shí)，G50-1的NR活性不是最高，但在LN條件下降幅最小，活性最高，表明其具有較強(qiáng)的耐低氮能力。

圖4 低氮脅迫對(duì)3種基因型光皮樺NR活性的影響Fig.4 Effects of LN stress on NR activity in three genotypes of B. luminifera

2.6 低氮脅迫下光皮樺硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)分析

低氮處理后葉片中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1.1和NRT1.2均下調(diào)表達(dá)(圖5-A)，但NRT2.1在G49-3中的相對(duì)表達(dá)量極顯著增加。根中表達(dá)模式與葉片中不同，NRT1.2在3個(gè)基因型光皮樺中均顯著下調(diào)表達(dá)，而NRT2.1極顯著上調(diào)表達(dá)(圖5-B)，這與NRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要通過根系吸收轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽有密切關(guān)系。本試驗(yàn)中，3個(gè)基因型光皮樺間NRT2.1表達(dá)水平變化存在極顯著差異，其中G49-3增幅最大，而優(yōu)3增幅最小。

2.7 3種基因型光皮樺耐低氮能力的綜合評(píng)價(jià)

光皮樺耐低氮能力受多種因素的綜合影響，上述用單一指標(biāo)來評(píng)價(jià)3種光皮樺基因型的耐低氮能力存在不一致性。為提高對(duì)光皮樺耐低氮能力評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)3個(gè)基因型光皮樺的葉綠素、根冠比、總干重、氮積累量、SOD活性、NR活性等17個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(表5)。基于隸屬函數(shù)平均值，3個(gè)基因型的耐低氮能力強(qiáng)弱依次為G50-1>優(yōu)3>G49-3。

表4 光皮樺耐低氮能力的綜合評(píng)價(jià)Table 4 Comprehensive evaluation of LN tolerance in B. luminifera

注：A：低氮脅迫下光皮樺葉中NRTs的表達(dá)分析；B：低氮脅迫下光皮樺根中NRTs的表達(dá)分析。Note: A: Expression analysis of NRTs in B. luminifera leaves under LN stress. B: Expression analysis of NRTs in B. luminifera roots under LN stress.圖5 低氮脅迫對(duì)3種基因型光皮樺NRTs的表達(dá)分析Fig.5 The expression analysis of NRTs in three genotypes of B. luminifera under LN stress

3 討論

3.1 低氮脅迫下不同基因型光皮樺的生長(zhǎng)響應(yīng)特征

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的營(yíng)養(yǎng)成分，為植物細(xì)胞重要的構(gòu)成元素。缺氮情況下，植物快速響應(yīng)低氮脅迫，形態(tài)和生物量均受影響，但受影響程度存在顯著基因型差異[23]。本研究對(duì)3種基因型光皮樺在低氮脅迫下生長(zhǎng)和生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析，并結(jié)合隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，G50-1 平均隸屬函數(shù)值(0.73)高于優(yōu)3(0.44)和G49-3(0.34)，表明光皮樺G50-1基因型為耐低氮型品種，而G49-3基因型為低氮敏感型品種。

本試驗(yàn)中，低氮脅迫下光皮樺表型變化明顯，植株矮小，葉色發(fā)黃。氮素是葉綠素分子的重要組成成分，環(huán)境中氮素減少影響葉綠素合成從而使光合作用受阻[24]。3種基因型光皮樺中G49-3的葉綠素含量降幅最大，G50-1降幅最小，即耐低氮基因型光皮樺在低氮環(huán)境中仍能保持較高葉綠素含量，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐低氮能力。張楚等[10]研究表明，在低氮條件下苦蕎(Fagopyrumtataricum)的株高、葉面積、地上部干重和地上氮含量均顯著低于正常組，且耐低氮基因型降幅均小于不耐低氮基因型。本研究中，低氮脅迫影響光皮樺幼苗生長(zhǎng)，地上部生長(zhǎng)受限而促進(jìn)根系生長(zhǎng)；耐低氮基因型G50-1受低氮脅迫影響較小，其地上部性狀指標(biāo)與不耐低氮基因型相比表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，對(duì)低氮環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)。

研究表明，低氮脅迫下植物根吸收的氮雖然先運(yùn)輸?shù)降厣喜?，但是更多同化氮?huì)被分配到根部從而使根冠比增加[1]。本試驗(yàn)中，低氮脅迫下G50-1光皮樺的根冠比增幅最大，這與李強(qiáng)等[24]的“耐低氮基因型玉米根冠比增幅低于氮敏感基因型”研究結(jié)果不一致，可能因?yàn)楣馄鍨槎嗄晟帜荆递^一年生農(nóng)作物更發(fā)達(dá)，且低氮脅迫同時(shí)影響光皮樺地上部和地下部生長(zhǎng)。低氮處理后，3種基因型光皮樺的總根長(zhǎng)、根系總表面積和平均直徑均增加，其中耐低氮基因型G50-1增幅最大。研究表明，當(dāng)土壤中NO3-有限時(shí)，根系形態(tài)特征對(duì)氮吸收尤為重要[25]，這與武永軍等[26]在氮虧缺條件下，植物為了盡可能尋找氮源而產(chǎn)生的補(bǔ)償效應(yīng)一致，這是植物在低氮條件下采取的最直接應(yīng)對(duì)方式之一。

3.2 低氮脅迫下不同基因型光皮樺的生理響應(yīng)特征

植物處于逆境時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除間平衡被破壞，植物啟動(dòng)相應(yīng)防御系統(tǒng)[27]。POD和SOD是植物細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的主要抗氧化酶，POD和SOD活性高低可以衡量植物在逆境條件下適應(yīng)能力的強(qiáng)弱[28]。本研究中，在低氮處理21 d后，3個(gè)基因型光皮樺幼苗保護(hù)酶活性均降低，其中G50-1下降最少，表明在低氮脅迫下耐低氮基因型能保持較高POD和SOD活性抵抗膜脂過氧化傷害，延緩葉片衰老[29]，從而更好地適應(yīng)低氮環(huán)境，這也是耐低氮基因型光皮樺耐低氮脅迫的重要生理機(jī)制之一。本試驗(yàn)中保護(hù)酶活性變化趨勢(shì)與李小冬等[30]研究的結(jié)果不一致，但與張定一[1]的研究結(jié)果相符，可能與植物受脅迫時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，短時(shí)間內(nèi)低氮脅迫能誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)，減輕逆境帶來的氧化傷害，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，低氮脅迫對(duì)植物造成不可逆?zhèn)?，從而?dǎo)致POD和SOD活性降低。

大多數(shù)植物從土壤中吸收的氮素是硝酸鹽(NO3-)，硝酸鹽在參與合成體內(nèi)含氮有機(jī)化合物之前，必須先還原為氨。NR是氮代謝過程中的關(guān)鍵酶[31]，能在一定程度上反映植株的營(yíng)養(yǎng)狀況以及硝酸鹽同化水平。本試驗(yàn)中，低氮處理后3個(gè)基因型光皮樺NR活性均不同程度降低，且耐低氮基因型降幅小于氮敏感基因型。

3.3 低氮脅迫下不同基因型光皮樺的分子響應(yīng)特征

4 結(jié)論

低氮脅迫下光皮樺幼苗生長(zhǎng)受到抑制，光皮樺株高、地上部干重、地上氮含量和氮積累量顯著降低，但低氮脅迫在一定程度上促進(jìn)根系生長(zhǎng)，表現(xiàn)為根冠比、根系總根長(zhǎng)、總表面積和平均直徑升高；低氮脅迫使光皮樺幼苗葉綠素含量，POD、SOD和NR活性下降，但高親和力吸收系統(tǒng)中NRT2.1表達(dá)量增加以更好地調(diào)節(jié)氮代謝適應(yīng)低氮環(huán)境。不同基因型光皮樺對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)存在顯著差異，耐低氮基因型在低氮環(huán)境中能保持較好生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，耐低氮能力更強(qiáng)。本研究結(jié)果為耐低氮脅迫種質(zhì)的篩選和培育提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)表明運(yùn)用常規(guī)遺傳改良手段篩選和培育耐低氮、氮高效的光皮樺良種是可行的。