盛美玲 汪群智

最新流行狀況調(diào)查顯示我國(guó)40歲以上人群COPD患病率已高達(dá)13.7%[1]。COPD患者非常容易出現(xiàn)反復(fù)的急性加重(AECOPD)，急性加重頻繁的患者有更快速的肺功能下降、更多的需要住院治療，并有抑郁、焦慮的發(fā)病率增加以及更差的生活質(zhì)量，嚴(yán)重影響患者的健康狀況[2]。因此，減少COPD急性加重的發(fā)生，是COPD治療的最重要目標(biāo)之一。近年來(lái)微生物高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，一些研究發(fā)現(xiàn)與COPD相關(guān)的呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)變化是急性加重發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要組成部分[3]。故而，了解呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)與COPD急性加重風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，指導(dǎo)靶向干預(yù)以減少COPD急性加重和病情進(jìn)展，有著重要的意義。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取我院呼吸內(nèi)科2017年3月至2018年6月間就診的穩(wěn)定期COPD患者60例作為研究對(duì)象，所有患者簽署知情同意書(shū)。依據(jù)COPD指南《GOLD：Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD，updated 2019》標(biāo)準(zhǔn)[4]，選擇在本院門診就診或出院后隨訪的穩(wěn)定期COPD患者，依據(jù)慢阻肺綜合評(píng)估方法，選擇急性加重風(fēng)險(xiǎn)高危組(A組)患者30例：患者上一年度發(fā)生過(guò)2次及以上的急性加重史或上一年度因急性加重住院1次，肺功能分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)(肺功能提示FEV1占預(yù)計(jì)值%<50%)；低危組(B組)患者30例：患者上一年度發(fā)生過(guò)少于2次的急性加重史，且上一年度未因急性加重住院，肺功能分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)(肺功能提示FEV1占預(yù)計(jì)值%≥50%)。當(dāng)肺功能風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與急性加重史評(píng)估結(jié)果不一致時(shí)，以評(píng)估得到的最高風(fēng)險(xiǎn)為準(zhǔn)。

二、分組

入組標(biāo)準(zhǔn)：COPD診斷符合GOLD 2019版《Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD，updated 2019》[4]診斷標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)并入組：在吸入支擴(kuò)劑后，第1秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值<70%并排除其它肺部疾??；患者均處于病情緩解穩(wěn)定期，近3月內(nèi)患者咳痰、呼吸困難或喘息癥狀穩(wěn)定，近2月內(nèi)未出現(xiàn)急性上呼吸道感染，近4周內(nèi)沒(méi)有使用抗菌藥物或全身性激素；簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他肺部疾病如哮喘、肺癌、支氣管擴(kuò)張癥、肺部結(jié)核等；有嚴(yán)重心、肝、腦、腎、癌癥、血液系統(tǒng)疾病、有自身免疫系統(tǒng)疾病者等。

三、方法

1 呼吸道標(biāo)本樣本收集

用1%的利多卡因液霧化進(jìn)行呼吸道局部麻醉，靜脈推注咪達(dá)唑侖2mg，患者取仰臥位，用纖維支氣管鏡行肺泡灌洗，將氣管鏡嵌入右肺中葉的一個(gè)亞段，頂端要緊密嵌頓亞段支氣管開(kāi)口，防止大氣道分泌物混入和灌洗液外滲，共注入加熱至37℃的滅菌生理鹽水150mL，每次20～50mL，總回收率≥30%，回收后，初步質(zhì)控，標(biāo)本合格要求：(1) 灌洗液中沒(méi)有大氣道分泌物的混入；(2) 回收率>40%，活細(xì)胞占95%以上；(3) 紅細(xì)胞<10%，上皮細(xì)胞<5%；(4) 細(xì)胞形態(tài)完整、無(wú)變形，分布均勻。然后送到實(shí)驗(yàn)室分裝后高速離心，后放置—80℃保存。同時(shí)留取5～10mL灌洗液送細(xì)菌室做細(xì)菌培養(yǎng)。

2 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A○Rsoil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，DNA純度利用NanoDrop2000檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為 20ul，4ul 5*FastPfu 緩沖液， 2ul 2.5mM dNTPs，0.8ul 引物， 0.4ul FastPfu 聚合酶；10ng DNA 模板。

3 高通量測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物后純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái) (Illumina, SanDiego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建 PE2*300 的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、臨床資料

兩組患者一般資料 急性加重風(fēng)險(xiǎn)高危組患者(A組)30例，其中男性24例，女性6例，平均年齡(71.1±11.6)歲；急性加重風(fēng)險(xiǎn)低危組(B組)患者30例，其中男性23例，女性7例，平均年齡(70.7±10.5)歲；兩組間性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、高通量測(cè)序結(jié)果

1 60例標(biāo)本稀釋曲線(圖1)。

2 60例標(biāo)本Alpha多樣性分析(表1)：測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組間呼吸道菌落在多樣性上無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 兩組患者呼吸道菌群Alpha多樣性指數(shù)組間差異數(shù)據(jù)表

圖1 60例BALF標(biāo)本稀釋曲線

當(dāng)曲線走向逐步趨向于平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠，由上圖可以看出，所有標(biāo)本曲線均趨向于平坦，提示測(cè)序量合理。

3 60例標(biāo)本門水平群落Bar圖(圖2)及屬水平Bar圖(圖3)：通過(guò)Bar圖我們可以發(fā)現(xiàn)，COPD患者BALF中微生物群非常豐富，且不同的樣本有著一定的差別，但主要以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主。但高危及低危組間微生物群在門、屬等水平上豐度有無(wú)差別仍需進(jìn)一步做組間物種差異分析。

圖2 所有標(biāo)本門水平群落Bar圖

圖3 所有標(biāo)本屬水平群落Bar圖

圖2、3注解：橫坐標(biāo)為相關(guān)物種在樣本中的比例，縱坐標(biāo)是樣本編碼，不同的物種以不同的顏色表示。

4 兩組之間物種在門水平(圖4)及屬水平(圖5)的豐度差異分析：我們發(fā)現(xiàn)，在門水平上，A組患者BALF中梭桿菌門豐度明顯低于B組(t=-1.998，P=0.049)；在屬水平上，A組患者BALF中假單胞菌屬豐度明顯高于B組(t=4.380，P=0.001)。其它門、屬水平菌群豐度則無(wú)明顯差異(P>0.05)。

圖4 兩組患者門水平物種豐度差異

圖5 兩組患者屬水平物種豐度差異

討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，下呼吸道微生物的實(shí)驗(yàn)室檢查主要依賴于呼吸道分泌物的細(xì)菌培養(yǎng)，但環(huán)境中大部分的微生物使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法并不能培養(yǎng)出，故而，人們長(zhǎng)期錯(cuò)誤的認(rèn)為肺部是無(wú)菌環(huán)境。近年來(lái)以高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的宏基因組學(xué)檢測(cè)方法的發(fā)展避免了分離培養(yǎng)的局限性，可全面深入的反映微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)[5]，使呼吸道菌群多樣性的研究得到了明顯的進(jìn)展。

近年來(lái)，基于16S rRNA的微生物結(jié)構(gòu)分析方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)呼吸道微生物群在結(jié)構(gòu)以及多樣性上非常豐富。Glendinning等[6]使用支氣管鏡對(duì)肺部取樣進(jìn)行16s RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)肺部的微生物群落豐富多樣。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)健康人群和COPD患者的肺部存在的主要菌群相仿，均以鏈球菌屬、普雷沃氏菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、梭桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、韋榮氏菌屬為主，但是健康人群和COPD患者肺部中的微生物群在豐度上存在差異[7]。Pragman等[8]通過(guò)對(duì)中重度COPD患者的肺泡灌洗液測(cè)序發(fā)現(xiàn)，中重度COPD患者下呼吸道內(nèi)變形菌門、厚壁菌門和放線菌門含量非常豐富。但是目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道COPD急性加重高危及低?；颊咧g呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)是否存在著差異。

我們通過(guò)對(duì)60例COPD患者的肺泡灌洗液行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，COPD患者BALF中微生物群非常豐富，以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主，與Cabrerarubio R[9]的研究高度一致，Ditz[10]通過(guò)對(duì)COPD患者的痰液菌群測(cè)序亦發(fā)現(xiàn)COPD患者呼吸道內(nèi)4大常見(jiàn)的菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。我們通過(guò)Alpha多樣性分析本研究發(fā)現(xiàn)兩組間微生物群的多樣性并無(wú)明顯差異，但是在豐度水平上部分菌群出現(xiàn)了一定差異，在門水平上，急性加重高危組患者BALF中梭桿菌門豐度明顯低于低危組；在屬水平上，急性加重高危組患者BALF中假單胞菌屬豐度明顯高于低危組。但是，是否由于這種菌群豐度的變化從而引起COPD的反復(fù)急性加重，本研究尚不能給出答案，仍需做進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，已經(jīng)有部分學(xué)者開(kāi)始研究相關(guān)微生物功能，Ditz等[10]利用宏基因組學(xué)技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)與健康個(gè)體相比，COPD呼吸道細(xì)菌碳水化合物代謝基因明顯減少，核苷和核苷酸基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，且氣流受限嚴(yán)重程度(FEV1)和細(xì)菌唾液酸代謝能力正相關(guān)。而Millares L[11]發(fā)現(xiàn)，在COPD穩(wěn)定期和急性加重的樣本之間，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)到支氣管微生物群的種屬差異變化，基于MG-RAST宏基因組技術(shù)平臺(tái)分析發(fā)現(xiàn)，在急性加重期患者中，細(xì)菌在碳水化合物代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡以及運(yùn)輸和分解代謝功能上出現(xiàn)了顯著的變化，揭示這種功能層面的變化而非種群結(jié)構(gòu)的變化可能與COPD反復(fù)急性加重有關(guān)。但是，目前功能基因的全宏基因組檢測(cè)費(fèi)用昂貴而限制了臨床的使用。

綜上所述，我們研究亦發(fā)現(xiàn)COPD患者的呼吸道微生物群非常豐富，以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主，COPD急性加重高危及低?；颊吆粑牢⑸锶旱亩鄻有圆o(wú)明顯差異，但是急性加重高危組患者BALF中梭桿菌門豐度明顯低于低危組，而假單胞菌屬豐度明顯高于低危組。但是，基于檢測(cè)費(fèi)用昂貴，我們目前完成的病例數(shù)仍較少，以后仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)目前的數(shù)據(jù)進(jìn)行修正確認(rèn)。