李威 史小芳 崔晶剛 林盪 周俊東

微小RNA(miRNA)是一種真核生物中廣泛存在的長(zhǎng)度約22nt的內(nèi)源性短鏈RNA分子，無(wú)法進(jìn)一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)的RNA，可通過與靶信使mRNA的3’UTR區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作用[1]。本研究實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定胸水中TP53INP1 mRNA與miRNA-155的表達(dá)，分析其表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌合并惡性胸腔積液患者臨床意義以及預(yù)后相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年2月至20017年6月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院的惡性胸腔積液患者42例，男22例、女20例，年齡30歲～69歲，平均(54.3±4.1)歲。細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)證實(shí)，其中腺癌26例、鱗癌16例，均為初治患者。選取良性胸腔積液患者21例，男13例、女8例，年齡18歲～70歲，平均(45.7±8.2)歲。其中結(jié)核性胸膜炎8例、肺炎7例、心衰4例、尿毒癥2例。良性胸腔積液診斷均經(jīng)過細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)檢查及臨床隨訪證實(shí)。

1 標(biāo)本采集

征得受試者知情同意后，對(duì)患者常規(guī)胸腔B超定位后行胸腔穿刺術(shù)，留取第2，3管胸水50mL分別置于兩個(gè)肝素抗凝瓶中。提取分離試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供。按操作步驟提取胸腔積液RNA。

2 研究方法

引物及內(nèi)參: 帶有柄環(huán)結(jié)構(gòu)的引物由廣州銳博生物科技有限公司提供，參考Chen等[2](見表1)。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) : 提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA 和 cDNA 樣品作為模板，檢測(cè)胸水脫落細(xì)胞中TP53INP1 mRNA、miRNA-155。反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng): 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2ul、引物0.2ul、dNTP 0.1ul、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5 ul、DEPC水5 ul、RNA模版 2 ul、總體積10 ul，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA放置-20℃保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)定量熒光PCR,SYBR Green染料10ul、上游引物1 ul、下游引物1 ul、dNTP 1ul、Taq聚合酶2ul、待測(cè)樣品cDNA 5ul、ddH2O 30 ul、總體積50ul(94℃ 15s，60℃ 60s) 50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)PCR儀自動(dòng)檢測(cè)一次熒光值。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸出每個(gè)cDNA模版標(biāo)本的擴(kuò)增曲線、CT值。由軟件自動(dòng)計(jì)算待測(cè)樣品,TP53INP1mRNA與miRNA-155,U6RNA含量。以U6RNA作為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)定量PCR中的相對(duì)定量法，以N=2-△Ct表示胸水miRNA相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct表示mRNA與內(nèi)參U6RNA的CT之差。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 RT-PCR引物序列及內(nèi)參

結(jié) 果

一、TP53INP1mRNA與miRNA-155在惡性胸水及良性胸水的表達(dá)及其相關(guān)性

表2 miRNA-155 和TP53INP1mRNA在良惡性胸水脫落細(xì)胞表達(dá)水平

二、惡性胸腔積液TP53INP1mRNA及miRNA-155的表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

惡性胸腔積液miRNA-155及TP53INP1mRNA表達(dá)與患者年齡，性別、腫瘤類型、腫瘤直徑及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，惡性胸腔積液miRNA-155及TP53INP1mRNA表達(dá)與腫瘤分化程度存在相關(guān)性，腫瘤低度分化組miRNA-155表達(dá)明顯高于高度分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)意義(見表3)。

三、惡性胸腔積液 miRNA-155的表達(dá)與臨床預(yù)后關(guān)系

42例惡性胸腔積液隨訪日期至2019年6月，結(jié)果42例惡性胸腔積液患者全部死亡，中位生存時(shí)間為321天。依據(jù)miRNA-155表達(dá)水平，將42例惡性胸水患者平均分為高表達(dá)組，低表達(dá)組。兩組患者隨訪期間治療情況及意外死亡事件發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表4)。miRNA-155表達(dá)與患者生存時(shí)間明顯相關(guān)，高表達(dá)組生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組，高、低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為253d、383d，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

表3 TP53INP1mRNA的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的臨床病理參數(shù)關(guān)系

表4 非小細(xì)胞肺癌患者miRNA-155高表達(dá)組與低表達(dá)組治療情況

圖1 惡性胸腔積液miRNA-155表達(dá)亞組的生存分析

討 論

miRNA在物種間具有較高的保守性、時(shí)序性和組織特異性，可能參與決定細(xì)胞和組織的功能特異性。miRNA的生物學(xué)功能主要通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，它們與靶基因組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制細(xì)胞及個(gè)體的重要生命活動(dòng)[3]。

大量研究證實(shí)miRNA-155在甲狀腺癌[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6]、結(jié)腸癌[7]等多種癌組織、血液，體液中高表達(dá)。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示檢測(cè)胸水miRNA-155的表達(dá)對(duì)診斷惡性胸水具有較高的特異性、敏感性，對(duì)惡性胸水的診斷具有一定的價(jià)值[8]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-155在NSCLC胸水中表達(dá)量，分析其與惡性胸腔積液患者臨床病理特征相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)與性別，年齡，病理類型，腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn)高miRNA-155表達(dá)與腫瘤細(xì)胞低度分化有關(guān)，提示miRNA-155可能參與腫瘤細(xì)胞分化等生物學(xué)過程。本研究miRNA-155表達(dá)與患者生存時(shí)間單因素相關(guān)性分析，兩組患者隨訪期間治療方案及意外死亡事件發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，惡性胸水組中miRNA-155高表達(dá)組、低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為253d、383d，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示miRNA-155高表達(dá)提示惡性胸水患者生存時(shí)間減少，預(yù)后差，與Yanaihara等[9]和Donnem等[10]的兩項(xiàng)非小細(xì)胞肺癌臨床研究文獻(xiàn)報(bào)道相符。Yanaihara等[9]研究了64例一期的肺腺癌患者，發(fā)現(xiàn)高miRNA-155和低let-7的表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后負(fù)面預(yù)測(cè)因子。Donnem等[10]采用原位雜交技術(shù)研究191例鱗癌，95例腺癌，31例大細(xì)胞癌和18例肺泡細(xì)胞肺癌患者，研究結(jié)果提示，miRNA-155在癌組織較癌旁組織中表達(dá)上調(diào)，miRNA-155在各種病理亞型中無(wú)顯著性差異，miRNA-155高表達(dá)組患者生存率明顯下降。本研究不足之處，由于初始資料樣本量限制，缺少亞組生存分析，以及多因素回歸分析，有待樣本量擴(kuò)大，進(jìn)一步研究。

TP53INP1是一種轉(zhuǎn)錄因子，TP53INPl能與P53、P73相互作用，誘導(dǎo)Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞應(yīng)激極化時(shí)表達(dá)上調(diào),能使細(xì)胞周期發(fā)生停滯，通過抗增殖、促凋亡來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)定性[11]。應(yīng)用生物信息學(xué)方法，miRNA-155靶向調(diào)節(jié)TP53INP1,miRNA-155與TP53INP1 mRNA3’-UTR結(jié)合，引起mRNA翻譯中止，或誘導(dǎo)其降解，調(diào)控基因表達(dá)[12]。Gironella等[13]在對(duì)胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，miRNA-155能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TP53INPl，抑制內(nèi)源性TP53INPl的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)惡性胸水患者miRNA-155表達(dá)與胸水細(xì)胞TP53INP1mRNA呈負(fù)相關(guān)，提示miRNA-155可能通過調(diào)控TP53INP1通路，從而在肺癌發(fā)生中起癌基因的作用，但是miRNA-155在肺癌中是否還調(diào)控其他信號(hào)通路及具體調(diào)控機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述．miRNA-155的高表達(dá)對(duì)診斷惡性胸水具有一定的價(jià)值,miRNA-155高表達(dá)提示預(yù)后差，生存時(shí)間減少，其可能靶向TP53INP1基因參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，下調(diào)miRNA-155表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有可能成為肺癌治療的靶基因。