李 艷， 耿慧娟， 邱思遠(yuǎn)， 王向華， 王 浩

（保定市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 071000）

布魯菌病是由布魯菌（Brucella）感染引起的人畜共患性疾病[1]，一般通過(guò)患病動(dòng)物傳播并感染給人類(lèi)，主要集中在地中海地區(qū)、亞洲地區(qū)和發(fā)展中國(guó)家流行。目前，這些地方的布魯菌病仍然是一個(gè)涉及人類(lèi)健康的、較嚴(yán)重的地方病[2-3]。我國(guó)目前仍以簡(jiǎn)單而廉價(jià)的試管凝集試驗(yàn)作為明確診斷布魯菌病最重要的確證試驗(yàn)之一[4]，然而試管凝集試驗(yàn)操作繁瑣、試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果判讀困難且存在主觀差異[5]。微柱凝膠技術(shù)是紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測(cè)新方法，具有操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)時(shí)間短、結(jié)果判讀清晰客觀、易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[6]。本研究創(chuàng)新性地將微柱凝膠技術(shù)應(yīng)用于布魯菌病的血清凝集試驗(yàn)中，取得了較好的效果。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

收集保定市人民醫(yī)院布魯菌病門(mén)診以發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的布魯菌病疑似患者血清樣本160份，陽(yáng)性質(zhì)控血清和陰性質(zhì)控血清購(gòu)自西班牙Linear公司。

1.2 主要儀器及試劑

布魯菌染色菌懸液（西班牙Linear公司）、多道電子加樣槍?zhuān)绹?guó)Thermo Scientific公司），LB-3000型血型血清學(xué)多用離心機(jī)（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司），12 mm×100 mm規(guī)格小試管、U型塑料微孔板（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司），0.85% NaCl溶液（石家莊四藥有限公司）。

1.3 自制3種微柱凝膠卡

分別稱取3種不同類(lèi)型（G50-Superfine、G50-Fine、G50-Medium，特性區(qū)別見(jiàn)表1）Sephadex-G50凝膠（美國(guó)GE公司）干粉各1 g，放入20 mL無(wú)菌0.85% NaCl溶液中充分混勻，室溫泡發(fā)24 h（泡發(fā)好的交聯(lián)葡聚糖凝膠顆粒為近圓球形，可以自然沉淀到0.85% NaCl溶液底部）。利用輸血科使用過(guò)的微柱凝膠抗篩卡（北京樂(lè)普公司），將內(nèi)容物用流水去除，將微柱凝膠抗篩卡洗凈、晾干后備用。采用微量加樣槍吸取上述3種泡發(fā)好的、不同規(guī)格的凝膠顆?；鞈乙杭尤肟瞻孜⒅磻?yīng)卡中（每管25 μL），然后將微柱凝膠卡放入專(zhuān)用血型血清學(xué)離心機(jī)中，700×g離心3 min，去除凝膠混懸液中含有的氣泡后，貼好標(biāo)簽備用。

表1 不同類(lèi)型Sephadex-G50凝膠干粉的特性

1.4 試驗(yàn)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 試管凝集試驗(yàn) 按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以0.85% NaCl溶液作為稀釋液，在小試管中將160份實(shí)驗(yàn)血清以1∶25～1∶800倍比稀釋?zhuān)缓笙蛎總€(gè)小試管中滴加50 μL布魯菌染色菌懸液，使菌懸液的最終稀釋度為1∶20倍，充分混勻后37 ℃孵育24 h后，肉眼檢查凝集情況，并判定結(jié)果。

1.4.2 微柱凝集試驗(yàn) 用0.85% NaCl溶液將布魯菌染色菌懸液原液稀釋10倍制備工作菌懸液。用0.85% NaCl溶液在U型微孔板中將實(shí)驗(yàn)血清按1∶12.5～1∶400進(jìn)行2倍比稀釋?zhuān)靠滓后w量為50 μL。將50 μL工作菌懸液加入各孔稀釋血清中，并充分混勻，于37 ℃溫箱孵育20 min后，將其加入自制的微柱凝膠卡，然后立即使用血型血清學(xué)離心機(jī)700×g離心20 min。當(dāng)抗原抗體反應(yīng)時(shí)，細(xì)菌會(huì)發(fā)生凝集，在一定的離心力作用下，凝集的藍(lán)色細(xì)菌顆粒不能通過(guò)凝膠間隙，被截留在凝膠表層或分散在凝膠當(dāng)中；而未凝集的藍(lán)色細(xì)菌在離心力的作用下，可通過(guò)凝膠間隙沉積于凝膠管的底部。

1.4.3 結(jié)果判定 參考文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行結(jié)果的判讀。如果血清中不存在特異性抗體，藍(lán)色布魯菌抗原會(huì)沉淀到微柱凝膠卡底部，判斷為陰性；當(dāng)血清中存在特異性抗體時(shí)，藍(lán)色抗原和抗體可形成復(fù)合物，離心后仍保留在凝膠上方，判定為陽(yáng)性。見(jiàn)圖1。

圖1 微柱凝集試驗(yàn)結(jié)果示意圖

1.5 質(zhì)量控制

為驗(yàn)證系統(tǒng)的有效性，并判讀結(jié)果，每批次試驗(yàn)均同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以試管凝集試驗(yàn)的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算微柱凝集試驗(yàn)的敏感性、特異性、假陰性率、假陽(yáng)性率、約登指數(shù)及符合率，一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3種自制微柱凝膠卡試驗(yàn)結(jié)果

3種自制微柱凝膠卡中，B卡（G50-Fine）試驗(yàn)結(jié)果最好，各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均達(dá)到非常滿意的程度；A卡（G50-Super fine）特異性為81.72%、假陽(yáng)性率為18.28%，結(jié)果較差；C卡（G50-Medium）的敏感性為46.27%、假陰性率為53.73%、Kappa值為0.50，結(jié)果非常不理想。見(jiàn)表2。

表2 3種自制微柱凝膠卡血清凝集試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)

2.2 3種自制微柱凝膠卡與試管凝集試驗(yàn)結(jié)果比較

與試管凝集試驗(yàn)結(jié)果比較，A卡有60份（37.5%）結(jié)果分布在箭頭線上，100份結(jié)果分布在箭頭線上方；B卡有146份（91.25%）結(jié)果分布在箭頭線上，1份結(jié)果分布在箭頭線上方，13份結(jié)果分布在箭頭線下方；C卡有62份（38.75%）結(jié)果分布在箭頭線上，98份結(jié)果分布在箭頭線下方；B卡的試驗(yàn)結(jié)果與試管凝集試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性最好。見(jiàn)圖2。

圖2 3種自制微柱凝膠卡和試管凝集試驗(yàn)血清凝集滴度測(cè)定結(jié)果比較

3 討論

葡聚糖凝膠是一種由葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的球形凝膠。1959年，美國(guó)法瑪西亞公司就開(kāi)始制造葡聚糖凝膠，主要利用其分子篩作用，通過(guò)凝膠過(guò)濾及離子交換色譜分析，進(jìn)行多肽分離、脫鹽、清洗生物提取液、相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定等[8]。1990年，LAPIERRE等[9]介紹了一種采用葡聚糖凝膠檢測(cè)紅細(xì)胞抗原抗體反應(yīng)的新技術(shù)，目前這種微柱凝膠免疫檢測(cè)技術(shù)主要在紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測(cè)中常規(guī)使用。從微柱凝膠免疫檢測(cè)技術(shù)的原理、本質(zhì)、特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)及其在臨床免疫實(shí)驗(yàn)診斷很多方面的需要來(lái)看，微柱凝膠免疫檢測(cè)技術(shù)不僅能用于紅細(xì)胞血型抗原抗體檢測(cè)，還可應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等致病微生物的抗原抗體檢測(cè)。

本研究團(tuán)隊(duì)前期在使用商品化血型血清學(xué)微柱凝膠卡（北京樂(lè)普公司）的研究基礎(chǔ)上，采用不同型號(hào)的進(jìn)口葡聚糖凝膠干粉研制專(zhuān)用于布魯菌血清凝集試驗(yàn)的微柱凝膠卡。將3種進(jìn)口凝膠干粉制備的不同微柱凝膠卡（A卡、B卡和C卡）與金標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行同期比對(duì)，結(jié)果表明：（1）采用G50-Fine干粉制備的A卡，試驗(yàn)敏感性高達(dá)100%，假陰性率為0，采用A卡進(jìn)行凝集試驗(yàn)?zāi)鼙ＷC將所有真陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)出來(lái)；但A卡的不足在于特異性只有81.72%，即其檢出的陽(yáng)性結(jié)果有18.28%為假陽(yáng)性；此外，A卡還有62.5%的試驗(yàn)結(jié)果與試管凝集試驗(yàn)的凝集滴度比對(duì)結(jié)果不理想，超過(guò)了試管凝集試驗(yàn)1～3個(gè)2倍稀釋度。（2）采用G50-Medium制備的C卡雖然特異性達(dá)100%，能夠?qū)⒄骊幮越Y(jié)果全部檢測(cè)出來(lái)，但是其敏感性僅為46.27%，假陰性率為53.73%、約登指數(shù)為0.46、Kappa值為0.5，均不理想，此外還有61.25%的試驗(yàn)結(jié)果的凝集滴度低于金標(biāo)準(zhǔn)1～3個(gè)2倍稀釋度。（3）采用G50-Fine干粉制備的B卡敏感性達(dá)到95.52%，假陰性率僅為4.48%，稍遜于A卡，遠(yuǎn)優(yōu)于C卡；且其特異性達(dá)94.62%，假陽(yáng)性率為5.38%，稍遜于C卡，遠(yuǎn)優(yōu)于A卡；也就是說(shuō)，B卡既具備A卡的高敏感性，同時(shí)也具備C卡的高特異性，可靠性評(píng)價(jià)分值在3種卡中最高，且B卡所得的試驗(yàn)結(jié)果中有91.25%的滴度和試管凝集試驗(yàn)的滴度一致。綜合上述結(jié)果來(lái)看，我們認(rèn)為在和試管凝集試驗(yàn)的比對(duì)中，不論是陰性結(jié)果，還是陽(yáng)性結(jié)果，在凝集滴度方面，B卡的試驗(yàn)結(jié)果都是3種卡中最優(yōu)秀的。

單純就本研究達(dá)到的最佳檢測(cè)效能來(lái)說(shuō)，在試驗(yàn)過(guò)程中我們還可以采取聯(lián)合檢測(cè)的策略：可以先將所有樣本用A卡檢出其中的陽(yáng)性標(biāo)本，然后再將檢出的陽(yáng)性標(biāo)本用C卡來(lái)排除陰性，這樣剩余的陽(yáng)性標(biāo)本則是假陽(yáng)性率和假陰性率均為0的試驗(yàn)結(jié)果，然后所有被排除的樣本再用B卡檢測(cè)其陰性、陽(yáng)性。但在臨床實(shí)驗(yàn)室中，由于標(biāo)本量大、試驗(yàn)人員少、檢測(cè)成本高等因素，使其實(shí)現(xiàn)起來(lái)較為困難。

3種自制凝膠卡試驗(yàn)結(jié)果的差異主要是由于3種原料干粉泡發(fā)后形成的球形凝膠的直徑不同造成的，球形凝膠的直徑與球形凝膠間形成的間隙大小呈正相關(guān)，凝膠直徑越大，間隙就越大，凝膠直徑越小，間隙就越小[10]。3種原料干粉中G50-Superfine泡發(fā)后直徑最小（20～50 μm），則其球形凝膠間形成的間隙最??；G50-Medium泡發(fā)后直徑（50～150 μm）在3種凝膠中最大，則其凝膠間隙也最大；G50-Fine泡發(fā)后直徑（20～80 μm）介于另2種凝膠的之間，則間隙G50-Super fine＜間隙G50-Fine＜間隙G50-Medium。

微柱凝膠免疫檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用在布魯菌血清凝集試驗(yàn)的核心原理是利用球形凝膠形成的間隙，合理地把布魯菌抗原與其特異性抗體結(jié)合形成的凝集顆粒截留在凝膠的表層。本研究結(jié)果表明，以G50-Fine干粉制備的凝膠間隙大小最適合做凝集顆粒的截留，因此B卡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和金標(biāo)準(zhǔn)相比最好；A卡的凝膠間隙相對(duì)偏小，造成一些較小的凝集顆粒也被截留，因此其假陽(yáng)性率提高到了18.28%；C卡凝膠間隙太大，和布魯菌血清凝集試驗(yàn)形成的顆粒大小不匹配，無(wú)法截留形成的凝集顆粒，因此評(píng)價(jià)指標(biāo)都不理想。

以G50-Fine干粉制備的B卡雖然取得了令人滿意的結(jié)果，但其在截留試管凝集試驗(yàn)為1∶25～1∶100凝集滴度的血清樣本時(shí)，其結(jié)果的相關(guān)性和金標(biāo)準(zhǔn)比較相對(duì)較差，這主要是由于當(dāng)血清中特異性抗體滴度較低時(shí)，抗原抗體反應(yīng)中比例失調(diào)過(guò)大，抗原抗體結(jié)合形成的凝集顆粒相對(duì)較小[11]，造成凝膠間隙無(wú)法截留這部分凝集顆粒。這是本研究中沒(méi)有解決的問(wèn)題，下一步我們擬用添加表面活性劑的緩沖溶液來(lái)取代本研究中采用的0.85% NaCl溶液，作為凝膠的泡發(fā)溶液，以降低凝膠的表面張力，同時(shí)提高凝膠溶液的浮力，來(lái)提高微柱凝膠卡對(duì)低凝集滴度血清的檢測(cè)能力。

總之，以G50-Fine凝膠干粉制備的微柱凝膠卡非常適用于布魯菌血清凝集試驗(yàn)，具有試驗(yàn)結(jié)果易于判定、準(zhǔn)確可靠、試驗(yàn)用時(shí)較短等優(yōu)點(diǎn)，在臨床中具有很好的應(yīng)用價(jià)值。