歐維正， 秦 萬(wàn)， 王 瓊， 王明棟， 張 娟， 徐 勇， 張廷梅

（貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心，貴州 貴陽(yáng) 550003）

結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的最嚴(yán)重的肺外結(jié)核病，占所有肺外結(jié)核病的5%～10%[1]，發(fā)病率高，病死率可達(dá)15%～30%[2]。目前，診斷TBM主要依據(jù)臨床癥狀和腦脊液檢測(cè)，其中病原學(xué)檢測(cè)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。腦脊液樣本中MTB載量低，導(dǎo)致抗酸染色法敏感性差，且不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous Mycobacterium，NTM）；培養(yǎng)法雖然結(jié)果精確、可靠，但培養(yǎng)周期為6～8周，易延誤治療。MTB核酸檢測(cè)技術(shù)分為2類(lèi)：一類(lèi)是以RNA擴(kuò)增為基礎(chǔ)、以DNA為檢測(cè)靶標(biāo)的核酸檢測(cè)技術(shù)，如熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），目前國(guó)內(nèi)外商品化的MTB核酸檢測(cè)試劑多基于此類(lèi)技術(shù)；一類(lèi)是以RNA擴(kuò)增為基礎(chǔ)、以為檢測(cè)靶標(biāo)的核酸檢測(cè)技術(shù)，如恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)（simultaneous amplification and testing，SAT）。MTB核酸檢測(cè)技術(shù)敏感性高、速度快，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床。本研究通過(guò)比較培養(yǎng)法、PCR和SAT檢測(cè)腦脊液樣本中MTB的效能，評(píng)價(jià)SAT在TBM診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年6月—2018年9月貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者496例，其中328例最終臨床診斷為T(mén)BM（TBM組）[男197例、女131例，年齡（33.5±18.7）歲]；另外168例經(jīng)臨床鑒別診斷排除TBM（對(duì)照組）[男100例、女68例，年齡（40.8±20.5）歲]。

1.2 主要儀器和試劑

ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）、Extractor 36核酸快速提取儀（北京博奧生物有限公司）、TL988實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司）、FZP-1核酸提純儀（上海仁度生物科技有限公司）、K30干式恒溫器（上海之信儀器有限公司）等；羅氏固體培養(yǎng)基和對(duì)硝基苯甲酸（p-Nitrobenzoic acid，PNB）培養(yǎng)基（珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司）、分枝桿菌核酸檢測(cè)（PCR-熒光探針?lè)ǎ┰噭┖校ū本┎W生物有限公司）、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)（RNA恒溫?cái)U(kuò)增法）試劑盒（上海仁度生物科技有限公司）。

1.3 方法

采集所有患者腦脊液樣本約6 mL，分2管送檢，1管（約2 mL）用于細(xì)菌培養(yǎng)，1管（約4 mL）用于PCR和SAT。

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將腦脊液樣本直接接種于羅氏固體培養(yǎng)基上，若滿(mǎn)8周仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，即報(bào)告培養(yǎng)陰性。分離到的菌株參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行PNB試驗(yàn)，如菌株在PNB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，則鑒定為NTM，反之鑒定為MTB。

1.3.2 PCR 將約2 mL腦脊液樣本按工作手冊(cè)[4]進(jìn)行PCR。樣本MTB擴(kuò)增曲線呈S型，且循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）＜36判定為MTB-DNA陽(yáng)性；樣本NTM擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值＜40判定為NTM-DNA陽(yáng)性；MTB-DNA和NTM-DNA均為陽(yáng)性時(shí)，判為MTB-DNA陽(yáng)性；MTB-DNA和NTM-DNA均為陰性時(shí)，判為無(wú)分枝桿菌檢出。以試劑盒自帶的陰性、陽(yáng)性對(duì)照作為質(zhì)控。

1.3.3 SAT 將約1.5 mL腦脊液樣本加入1.5 mL離心管中，14 170×g離心5 min，棄上清；加入50 μL MTB-RNA稀釋液，充分震蕩后懸浮，制成待測(cè)樣本。將待測(cè)樣本和50 μL陰性對(duì)照放入FZP-1核酸提純儀內(nèi)（液體要浸在水面以下），超聲處理15 min后取出，再14 170×g離心5 min，上清即為提取的RNA。取2 μL提取好的RNA加入含30 μL擴(kuò)增檢測(cè)液的潔凈微量反應(yīng)管中，于K30干式恒溫器內(nèi)60 ℃放置10 min，再42 ℃放置5 min，之后保持在42 ℃，加入10 μL SAT酶；采用TL988實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增（42 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，每分鐘采1次熒光，選取FAM通道）。結(jié)果判斷：Ct值＜40判定為MTB-RNA陽(yáng)性，Ct值≥40判定為MTBRNA陰性。以試劑盒自帶的陰、陽(yáng)性對(duì)照作為質(zhì)控。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBM組和對(duì)照組3種方法檢測(cè)結(jié)果

496例腦脊液樣本中，培養(yǎng)法分離到37株（7.46%）菌株，經(jīng)PNB試驗(yàn)鑒定均為MTB。PCR檢測(cè)檢出MTB-DNA陽(yáng)性22例（4.44%），SAT檢出MTB-RNA陽(yáng)性51例（10.28%）。見(jiàn)表1。

表1 TBM組與對(duì)照組3種方法檢測(cè)結(jié)果 例

2.2 以臨床診斷TBM為金標(biāo)準(zhǔn)，TBM組和對(duì)照組3種方法MTB檢測(cè)效能比較

SAT檢測(cè)MTB的敏感性最高（15.24%），與培養(yǎng)法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.24，P＞0.05）；與RCR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.23，P＜0.05）。培養(yǎng)法和PCR檢測(cè)MTB的特異性均為100%，但與SAT（特異性為99.40%）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.00，P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3種方法MTB檢測(cè)效能

2.3 以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，TBM組3種方法MTB檢測(cè)結(jié)果比較

T B M組3 2 8例腦脊液樣本中，7 7例（23.48%）檢測(cè)到MTB。以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，SAT的符合率為82.01%，敏感性為37.84%，特異性為87.6%。PCR的符合率為86.89%、敏感性為21.62%、特異性為95.19%。見(jiàn)表3。

表3 TBM組3種方法MTB檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

TBM屬于重癥結(jié)核病，是結(jié)核病患者死亡的主要原因之一。對(duì)TBM患者進(jìn)行早期診斷、規(guī)范治療，可顯著降低其致殘率、致死率[5]。由于TBM患者病情輕重程度不同、就診階段不同、臨床表現(xiàn)多樣，加之腦脊液實(shí)驗(yàn)室檢查特征性結(jié)果較少，導(dǎo)致確診TBM的難度較大，但檢出腦脊液樣本中的MTB仍然是確診TBM的金標(biāo)準(zhǔn)。

SAT方法是基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（transcription mediated amplification，TMA）和恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的核酸檢測(cè)技術(shù)，其原理是通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的MTB核糖體RNA擴(kuò)增引物及優(yōu)化探針技術(shù)，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及極高轉(zhuǎn)錄活性的T7 RNA多聚酶同時(shí)實(shí)現(xiàn)核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，能夠快速、直觀地反映樣本中有無(wú)MTB。與傳統(tǒng)的基于DNA模板的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)為[6]：（1）對(duì)儀器的要求低，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性和結(jié)果準(zhǔn)確性高；（2）起始靶標(biāo)為環(huán)境中極易降解的RNA，可有效避免污染；（3）因RNA只在活菌中存在，SAT還可監(jiān)測(cè)疾病活動(dòng)性及藥物療效；（4）RNA拷貝數(shù)比DNA的拷貝數(shù)高，并且熒光標(biāo)記的RNA探針可同步檢測(cè)擴(kuò)增信號(hào)，提高檢測(cè)敏感性。

本研究采用培養(yǎng)法、PCR和SAT對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行同步檢測(cè)，比較3種方法檢測(cè)結(jié)果，以評(píng)估SAT快速檢測(cè)腦脊液樣本中MTB的效能，結(jié)果顯示，以臨床診斷TBM作為標(biāo)準(zhǔn)，SAT檢測(cè)MTB的敏感性為15.24%，與培養(yǎng)法（11.28%）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與PCR（6.71%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與張海晴等[7]的研究結(jié)果一致。目前，關(guān)于SAT檢測(cè)腦脊液樣本的研究較少，而對(duì)其檢測(cè)痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液等樣本的研究[8-9]較多，結(jié)果均顯示SAT對(duì)這些樣本中的MTB有較高的檢測(cè)敏感性，并優(yōu)于培養(yǎng)法。本研究采用的3種方法在操作上均無(wú)需對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行前處理，保證了3種方法檢測(cè)前樣本的一致性，增加了檢測(cè)結(jié)果的可比性。但因腦脊液載菌量低、取樣量少，抗結(jié)核藥物治療后腦脊液細(xì)菌負(fù)荷量迅速下降[10]等因素，往往導(dǎo)致MTB檢測(cè)敏感性不高。2009年，英國(guó)感染學(xué)會(huì)建議TBM患者在抗結(jié)核藥物治療前留取不少于6 mL的腦脊液進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，并且在檢測(cè)前將腦脊液樣本3 000×g離心至少20 min[11]。

本研究結(jié)果顯示，SAT檢測(cè)MTB的特異性為99.40%，略低于培養(yǎng)法和PCR（100%），但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SAT和PCR同屬于分子生物學(xué)檢測(cè)方法，控制實(shí)驗(yàn)室污染是檢測(cè)成功的關(guān)鍵。2000年，BARAN等[12]指出，SAT雖然具有一定的檢測(cè)效率，但仍然存在一定的假陽(yáng)性率與假陰性率。盡管SAT檢測(cè)的RNA易降解，但操作不當(dāng)仍然可能會(huì)造成污染。本研究SAT檢測(cè)出現(xiàn)1例假陽(yáng)性，提示該技術(shù)在操作過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格遵守各項(xiàng)規(guī)范，避免人為因素降低其檢測(cè)效能。

本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)法MTB陽(yáng)性檢出率與SAT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與PCR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAT對(duì)腦脊液MTB的檢測(cè)效果更接近培養(yǎng)法，優(yōu)于PCR和SAT，有明顯的快檢優(yōu)勢(shì)。

RNA降解快，如果患者的腦脊液含菌量不多，而SAT操作時(shí)間控制不當(dāng)，如放在核酸提純儀中超聲處理留置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也可能會(huì)造成SAT對(duì)MTB的檢出率下降[13]；另外，若樣本中或容器內(nèi)存在核酸擴(kuò)增抑制劑，檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的可能性會(huì)增加[14]。這些均可能導(dǎo)致部分結(jié)果培養(yǎng)法為陽(yáng)性，而SAT檢測(cè)陰性。

本研究結(jié)果表明，3種方法腦脊液MTB陽(yáng)性總檢出率為23.48%，優(yōu)于單一使用任一方法。目前，尚無(wú)一種可快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病的方法，采用SAT、PCR等快速分子診斷技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，不僅可以提高診斷率，還可以縮短診斷周期，為臨床對(duì)結(jié)核病的診治提供更準(zhǔn)確、更快速的依據(jù)。

綜上所述，SAT能快速檢測(cè)腦脊液中的MTB，敏感性較高，可用于對(duì)TBM患者進(jìn)行早期診斷。3種方法聯(lián)合檢測(cè)可提高腦脊液MTB的陽(yáng)性檢出率。