別立翰， 房 萌， 馮惠娟， 陸志成， 高春芳

（1. 上海東方肝膽外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200438；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 200137）

在我國腫瘤總體發(fā)病率中，原發(fā)性肝癌居第4位，其引起的死亡率居腫瘤總體死亡率的第2位，肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其主要的病理類型[1]。在我國，80%的HCC由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起，乙型肝炎相關(guān)肝硬化患者是HCC的高危人群[2]。超聲及甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）聯(lián)合檢測常作為早期肝癌的常規(guī)篩查手段，但肝硬化患者的肝臟回聲增粗影響了超聲對小肝癌的識別。Meta分析結(jié)果顯示，對于肝硬化患者早期肝癌的診斷，超聲的敏感性只有47%，超聲聯(lián)合AFP后敏感性可提高至63%[3]。糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的主要修飾形式，腫瘤發(fā)生過程中蛋白質(zhì)等的異常糖基化賦予了腫瘤細(xì)胞新的生物學(xué)特性，影響著腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡、免疫逃逸及血管生成[4]。巖藻糖基化及唾液酸化是2種主要的糖基化修飾。異常糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，如甲胎蛋白異質(zhì)體（Lens culinaris-agglutinin-reactive fraction of alpha-fetoprotein，AFP-L3）和α2，3唾液酸化前列腺特異性抗原等可作為腫瘤標(biāo)志物用于相關(guān)腫瘤的診斷[5]。

觸珠蛋白是主要由肝臟合成分泌的一種酸性糖蛋白，屬于急性時相反應(yīng)蛋白。觸珠蛋白分子結(jié)構(gòu)類似于免疫球蛋白，有2條β鏈（相對分子質(zhì)量為40 000）、2條α鏈（α1、α2鏈的相對分子質(zhì)量分別為9 100和16 000）。觸珠蛋白的主要功能是結(jié)合并攜帶游離的血紅蛋白在肝臟中被降解，以防止發(fā)生血管內(nèi)溶血時腎臟受損。有研究結(jié)果顯示，觸珠蛋白在多種腫瘤發(fā)生時糖基化修飾發(fā)生改變，如胰腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和胃癌[6]。本研究采用本課題組前期研發(fā)的乏糖基觸珠蛋白抗體捕獲血清觸珠蛋白，使用可與α2，6唾液酸特異性結(jié)合的接骨木黑凝集素（sambucus nigra lectin，SNA）檢測觸珠蛋白上的唾液酸，建立凝集素-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Lectin enzyme-linked immunosorbent assay，Lectin-ELISA）方法，探討唾液酸化觸珠蛋白（sialylated haptoglobin，Sia-Hp）在HCC早期篩查中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1—12月在上海東方肝膽外科醫(yī)院被確診為乙型肝炎相關(guān)肝硬化的患者236例，其中肝硬化伴HCC患者121例（HCC組，男112例，女9例，年齡48～60歲）、肝硬化不伴HCC患者115例（肝硬化組，男80例，女35例，年齡48～63歲）。收集所有患者的實(shí)驗(yàn)室檢測資料及HCC患者的病理資料[腫瘤TNM分期、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）和腫瘤大小]。HCC診斷依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》[7]，肝硬化診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）[8]。另選取同期上海東方肝膽外科醫(yī)院健康體檢者107名作為正常對照組（男53名，女54名，年齡24～41歲）。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 HCC組 （1）有明確的HBV感染病史；（2）經(jīng)手術(shù)治療的患者病理明確診斷為肝硬化伴HCC；（3）排除 HBV之外的其他病毒感染，如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等；（4）排除其他臟器的嚴(yán)重疾病或惡性腫瘤；（5）排除其他原因引起的慢性肝病。

1.2.2 肝硬化組 （1）有明確HBV感染史；（2）臨床診斷為慢性乙型肝炎相關(guān)肝硬化；（3）排除其他原因引起的肝硬化，如原發(fā)性膽汁性肝硬化、酒精性肝硬化、血吸蟲肝硬化等。

1.2.3 正常對照組 （1）無肝臟疾病史，肝臟生化指標(biāo)均正常；（2）排除腫瘤、感染性疾病、重要臟器的嚴(yán)重疾病及自身免疫性疾病等。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集HCC患者術(shù)前靜脈血3 mL，采集肝硬化患者及正常對照者空腹靜脈血3 mL，2 100×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存待用。由于觸珠蛋白具有與血紅蛋白結(jié)合的生物學(xué)特性，溶血會對檢測結(jié)果造成較大影響，因此需剔除溶血樣本。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢測資料 收集所有對象的實(shí)驗(yàn)室檢測資料，包括總膽紅素（total bilirubin，TB）、總蛋白（total protein，TP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、AFP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。

1.3.3 檢測Sia-Hp的Lectin-ELISA方法的建立 將乏糖基觸珠蛋白抗體以4 μg/mL包被在96孔板中。使用Carbo-Free Blocking Solution（美國Vector Laboratories公司）封閉板孔，以減少非特異性吸附。用含0.1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS），即PBST洗板。用Low cross buffer（德國CANDOR Bioscience公司）將血清稀釋10 000倍，以100 μL/孔加樣，室溫孵育1 h。使用PBS將生物素化SNA（美國Vector Laboratories公司）稀釋10 000倍，每孔加入100 μL，室溫避光放置1 h。以100 μL/孔加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素（美國R&D System公司），室溫孵育40 min后加入四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色，在450 nm處讀取吸光度（A）值。每份樣本雙復(fù)孔檢測，檢測結(jié)果的單位為AU/mL。將提前制備的混合血清與樣本一同檢測，以混合血清為參照，取樣本A值與混合血清A值的比值，以降低檢測的批間及批內(nèi)誤差。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman等級相關(guān)分析評估各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價Sia-Hp、AFP診斷肝硬化合并HCC的效能，曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組、肝硬化組和正常對照組一般資料的比較

HCC組、肝硬化組和正常對照組之間年齡、TB、TP、ALT、WBC計數(shù)、AFP、CEA差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC組、LC組和正常對照組一般資料的比較 M（P25～P75）

2.2 HCC組、肝硬化組和正常對照組血清Sia-Hp水平的比較

HCC組、正常對照組、肝硬化組血清Sia-Hp水平分別為1.76（1.32～2.22）、1.60（1.17～1.69）、0.85（0.11～1.56）AU/mL，3組之間依次降低（P＜0.001）。見圖1。

2.3 血清Sia-Hp水平與臨床病理特征的關(guān)系

Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，HCC組和肝硬化組Sia-Hp與AFP無相關(guān)性（r=0.09，P＞0.05）。

在HCC組中，TNM 1期患者的血清Sia-Hp水平低于TNM 2+3+4期（P＜0.05），有MVI的患者與無MVI的患者之間以及腫瘤＜3 cm、3～5 cm、＞5 cm的患者之間血清Sia-Hp水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。肝硬化組不同Childpugh分級患者之間血清Sia-Hp水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.4 Sia-Hp診斷肝硬化合并HCC的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，Sia-Hp診斷肝硬化合并HCC的AUC[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]為0.83（0.77～0.88），最佳臨界值為1.06 AU/mL，敏感性為95.0%，特異性為56.5%。AFP診斷肝硬化合并HCC的AUC（95%CI）為0.78（0.72～0.84），以20 μg/L為診斷臨界值時，敏感性為55.4%，特異性為80.9%。Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Sia-Hp與AFP診斷肝硬化合并HCC的AUC差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.12，P＞0.05）。見圖3。

圖1 HCC組、肝硬化組和正常對照組血清Sia-Hp水平的比較

圖2 HCC組不同病理特征之間及肝硬化組不同Child-Pugh分級之間血清Sia-Hp水平的比較

采用多因素Logistic回歸分析建立基于AFP和Sia-Hp的聯(lián)合檢測模型DIAHCC，DIAHCC=2.755×Sia-Hp+1.852×logAFP-5.756。ROC曲線分析結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的AUC（95%CI）為0.92（0.89～0.96），最佳臨界值為0.475，敏感性為88.4%，特異性為84.3%。Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的AUC高于AFP、Sia-Hp（P＜0.001）。見圖3。

2.5 Sia-Hp及聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性患者肝硬化合并HCC的效能

以AFP＜20 μg/L為AFP陰性。HCC組有54例患者血清AFP為陰性，其血清Sia-Hp水平為1.84（1.62～2.27）AU/mL。肝硬化組有93例患者血清AFP為陰性，其血清Sia-Hp水平為1.16（0.14～1.64）AU/mL。2個組AFP陰性者之間血清Sia-Hp水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 Sia-Hp、AFP和聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的ROC曲線

ROC曲線分析結(jié)果顯示，Sia-Hp和聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性患者肝硬化合并HCC的AUC（95%CI）分別為0.84（0.77～0.90）、0.88（0.82～0.94），分別以1.06 AU/mL、0.475作為臨界值，敏感性分別為96.3%、77.8%，特異性分別為49.5%、89.2%。Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Sia-Hp和聯(lián)合檢測模型DIAHCC的AUC之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Sia-Hp及聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性患者肝硬化合并HCC的ROC曲線

3 討論

腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)的異常唾液酸修飾可賦予腫瘤不良的生物學(xué)特性。ZHAO等[9]對101例肝癌患者的癌組織及癌旁組織中20種唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，癌組織中催化形成α2，6唾液酸的α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶1（ST6 beta-galactoside alpha-2，6-sialyltransferase 1，ST6GAL1）的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P＜0.05），他們還發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系MHCC97 H中ST6GAL1的表達(dá)量比MHCC97 L高了近5倍。由此可見，隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤細(xì)胞α2，6結(jié)構(gòu)的唾液酸修飾增多，因此主要由肝臟分泌的α2，6唾液酸修飾的蛋白或可作為腫瘤早期診斷的指標(biāo)。近80%的肝癌患者由HBV感染相關(guān)肝硬化發(fā)展而來，肝硬化是乙型肝炎相關(guān)肝癌的獨(dú)立危險因素[10]。因此，探索乙型肝炎相關(guān)肝硬化發(fā)展成為肝癌的早期篩查指標(biāo)對于患者預(yù)后意義重大。LI等[11]的研究結(jié)果顯示，男性、AFP＞200 ng/mL、HBV感染家族史是年輕乙型肝炎相關(guān)肝硬化患者快速進(jìn)展為肝癌的危險因素，應(yīng)盡早進(jìn)行肝癌篩查。

ANG等[12]使用凝集素純化及雙向電泳技術(shù)對血清觸珠蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，肝癌患者血清觸珠蛋白唾液酸化程度高于慢性肝病患者，且Sia-Hp與腫瘤分期相關(guān)。本研究為了探討Sia-Hp輔助診斷HCC的價值，首先構(gòu)建了檢測Sia-Hp的Lectin-ELISA方法，所使用的乏糖基觸珠蛋白抗體不含唾液酸，從而降低了檢測體系的本底，提高了檢測靈敏度，所采用的SNA可與觸珠蛋白β鏈上的α2，6唾液酸特異性結(jié)合。

本研究結(jié)果顯示，HCC患者血清Sia-Hp水平高于肝硬化患者和正常對照者（P＜0.001），肝硬化患者血清Sia-Hp水平最低。針對觸珠蛋白N-糖鏈的質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，HCC患者血清觸珠蛋白N-糖鏈結(jié)構(gòu)上的唾液酸含量高于肝硬化患者[13]。本研究采用Lectin-ELISA得出的檢測結(jié)果與文獻(xiàn)報道[14]相似。

腫瘤TNM分期是評價患者預(yù)后的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，TNM 1期HCC患者的血清Sia-Hp水平低于TNM 2+3+4期HCC患者（P＜0.05），提示Sia-Hp有預(yù)測患者預(yù)后的潛能。MVI是HCC患者手術(shù)預(yù)后和總生存期的獨(dú)立危險因素，在不同TNM分期的HCC患者中均有發(fā)生。LEI等[15]的研究結(jié)果顯示，約有30%的HBV相關(guān)HCC患者會發(fā)生MVI，且MVI與HCC患者腫瘤大小、腫瘤多發(fā)結(jié)節(jié)、包膜不完整和高HBV DNA載量有關(guān)。MVI作為HCC患者術(shù)后病理檢查的指標(biāo)，目前尚缺乏相關(guān)的血清標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，有MVI的HCC患者血清Sia-Hp水平雖稍高于無MVI的HCC患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且不同腫瘤大小的HCC患者之間血清Sia-Hp水平差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），肝硬化組不同Child-pugh分級之間血清Sia-Hp水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，基于Sia-Hp和AFP建立的聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的AUC高于AFP、Sia-Hp（P＜0.001），Sia-Hp與AFP的AUC差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在AFP陰性患者中，Sia-Hp對肝硬化合并HCC仍有良好的診斷效能（AUC為0.836）。有研究結(jié)果顯示，有15%～30%的肝癌患者血清AFP不升高[14]。依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》[7]，以AFP＜20 μg/L為AFP陰性，聯(lián)合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性的肝硬化合并HCC的敏感性和特異性分別為77.8%和89.2%。這提示在AFP陰性的人群中，聯(lián)合檢測模型DIAHCC對HCC也有較好的診斷效能。

綜上所述，Sia-Hp在肝硬化合并HCC的輔助診斷中有一定的價值，且與AFP聯(lián)合檢測時診斷效能更高，或可作為HCC的輔助診斷標(biāo)志物之一。另外，由于唾液酸化還可影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，且唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)，因此Sia-Hp可能在HCC的預(yù)后評估中也有一定的價值。